CGMMV外殼蛋白和復制相關蛋白基因突變體致病性分析.pdf

1、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)是葫蘆科作物上的重要病毒之一，給葫蘆科作物的生產(chǎn)造成了嚴重的威脅。近十年來，CGMMV在世界范圍內的蔓延范圍仍在不斷擴大。本文以CGMMV不同突變體為研究對象，對其突變體致病性進行分析，發(fā)現(xiàn)決定致病性的關鍵位點，進一步了解該病毒致病的分子機理。
　　病毒外殼蛋白不僅是病毒正常組裝所必須的，還參與了病毒的長距離運輸過程。通過農桿菌浸

2、潤接種的方法，對CGMMV CP丙氨酸掃描文庫各個突變體在本生煙和西瓜上的致病性進行了初步篩選，并通過DAS-ELISA和一步RT-PCR對病毒進行檢測。在接種本生煙后，所有的134個突變體中，有23個丙氨酸突變體在接種本生煙后癥狀發(fā)生改變，且突變前大部分為非極性氨基酸。還有49個突變體在接種后未顯癥，且病毒檢測為陰性。另外，癥狀改變的突變體在CP蛋白亞基上的定位有一定可循規(guī)律，23個突變位點全部定位于四個α螺旋內側的中空結構區(qū)域內，且

3、在三級結構上位于病毒外殼蛋白亞基外表面區(qū)域。
　　黃瓜綠斑駁花葉病毒的病毒起始裝配位點是位于病毒基因組RNA上，當外殼蛋白聚合體與病毒基因組RNA相結合從而引導病毒起始裝配的核苷酸區(qū)域。在對病毒起始裝配位點及其附近區(qū)域盼突變體V94A、V97、T104A進行致病性分析時，我們發(fā)現(xiàn)，這三個突變體接種后都能導致本生煙癥狀的明顯延遲，并且它們的外殼蛋白第96位氨基酸都有一個共同的替換型自發(fā)性突變，由谷氨酸替換突變?yōu)橘嚢彼?。在V94A、V

4、97、T104A的基礎上，人工插入E96-K突變構建了雙位點突變體V94A-E96K、V97-E96K和T104A-E96K，并構建了E96K和E96A。分別利用農桿菌浸潤接種和摩擦接種的方法接種了本生煙和西瓜。我們總結出外殼蛋白第96位氨基酸在CGMMV致病過程中發(fā)揮著重要作用，也首次證明了病毒起始裝配位點及其鄰近區(qū)域能夠影響病毒致病性。
　　為了篩選癥狀致弱的CGMMV弱毒株，參考已有研究的弱毒株相關致弱位點，利用定點突變的方

5、法構建了單位點突變體E480G、A1124V、N1157D、P1397S、K546R、V557T、V651A、S762L、G86S、S534F、P1362L，還有雙位點突變體和多位點突變體480-1124、546-557、86-534、480-1124-1157、546-557-651、86-534-1362、GVDS和RTAL。通過比對這些突變體的致病性，我們發(fā)現(xiàn)位于復制相關蛋白結構域間隔區(qū)的氨基酸第480位點能夠引起癥狀的延遲，而當