碳酸酐酶法測(cè)定生物樣品中鋅含量的方法學(xué)研究及臨床應(yīng)用初探.pdf

1、目的 建立一個(gè)靈敏、準(zhǔn)確、特異、試劑穩(wěn)定的碳酸酐酶自動(dòng)生化分析法用于檢測(cè)生物樣品中的鋅含量。探討碳酸酐酶法檢測(cè)鋅的方法學(xué)性能并將建立的方法進(jìn)行初步臨床應(yīng)用研究。 方法 1制備去輔基碳酸酐酶(apoCA)，并配制成3mg/ml濃度，以NaN3防腐，作為試劑2(R2)。 2.探索檢測(cè)血清、頭發(fā)、尿液等生物樣品中鋅含量的標(biāo)本預(yù)處理方法。 3.進(jìn)行最適實(shí)驗(yàn)條件探索及項(xiàng)目?jī)x器參數(shù)設(shè)置：如反應(yīng)類型，反應(yīng)溫度，

2、檢測(cè)波長(zhǎng)，樣品用量，試劑用量，各試劑加入時(shí)間，反應(yīng)延滯期，讀數(shù)時(shí)間等。 4.進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、回收實(shí)驗(yàn)、干擾實(shí)驗(yàn)、方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)等方法學(xué)系列評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法學(xué)性能。 5.檢測(cè)一定數(shù)量的甲狀腺功能亢進(jìn)癥患者空腹血清鋅濃度和一定數(shù)量的腎小球源性血尿患者的第二次晨尿標(biāo)本鋅濃度、尿鋅/尿肌酐比值，進(jìn)行初步臨床應(yīng)用研究。對(duì)一定數(shù)量?jī)和难邃\、發(fā)鋅及尿鋅水平進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，探討三個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性。 結(jié)果 1.反應(yīng)緩沖液的

3、選擇：pH8.00.5mol/LTris-HCl緩沖液能中和無蛋白濾液中的三氯醋酸(TCA)。在該條件下，試劑本底吸光度適中，此緩沖液作為試劑1(R1)測(cè)定鋅最適合。 2.配制底物時(shí)加入乙腈，不僅具有促溶作用，而且能使底物穩(wěn)定，使保存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。酶試劑中加入NaN3能明顯延長(zhǎng)酶試劑的保存時(shí)間。 3.分析樣品制備：在制備無蛋白濾液時(shí)，血清中加入等量5％TCA不僅能使血清中蛋白變性，而且能使鋅離子解離出來；3％TCA與尿液

4、等量混合后能使尿中蛋白質(zhì)沉淀較完全，而不會(huì)引起尿蛋白定性為陰性的尿標(biāo)本鋅測(cè)定結(jié)果偏低。因此，選用3％TCA作為尿蛋白質(zhì)沉淀劑、5％TCA作為血清蛋白沉淀劑比較合適。 4.我們將酶試劑設(shè)置成R2試劑比Erel將酶試劑設(shè)置為R3試劑更具有科學(xué)性，它可使鋅離子與脫輔基碳酸酐酶能有足夠的作用時(shí)間，有利于無活性的碳酸酐酶充分復(fù)活，使加入底物后，酶促反應(yīng)的延滯期縮短。 5.參數(shù)設(shè)置時(shí)采用兩點(diǎn)定標(biāo)，通過扣除試劑空白速率，能消除酶試劑中

5、殘留鋅的干擾，即使碳酸酐酶透析時(shí)鋅去除不完全，含有極微量，對(duì)鋅的測(cè)定也不會(huì)產(chǎn)生影響。 6.方法性能：0～61.2μmol/L濃度范圍內(nèi)線性良好。血清鋅批內(nèi)CV值小于3.0％，批間CV值小于為4.2％。發(fā)樣鋅批內(nèi)CV值小于2.1％，批間CV值小于2.8％。尿液鋅批內(nèi)CV值小于3.5％，批間CV值小于4.9％。血清鋅回收率為96.4％～104.7％，平均101.4％。發(fā)樣鋅回收率為95.4％～104.6％，平均為100.4％。尿液鋅

6、回收率為95.6％～103.8％，平均回收率為為99.7％。Cu2+、Fe2+、Mn2+各200μmol/L、Co2+10μmol/L、膽紅素342μmol/L對(duì)本法測(cè)定血鋅、尿鋅均無影響。血紅蛋白5.0g/L、甘油三酯15.0mmol/L以下對(duì)本法測(cè)血清鋅無干擾。發(fā)消化液中Cu2+、Fe2+、Mn2+各2000μmol/L、Co2+100μmol/L對(duì)本法測(cè)定發(fā)鋅均無影響。用碳酸酐酶法(Y)和原子吸收法(X)對(duì)血鋅、發(fā)鋅、尿鋅進(jìn)行分析

7、，其回歸方程分別為Y=0.99X-0.15、Y=X-0.33、Y=1.03X-0.10，r值分別為0.988、0.98、0.994。 7.檢測(cè)了30例甲狀腺功能亢進(jìn)癥患者及30例健康對(duì)照者血清鋅水平，發(fā)現(xiàn)甲狀腺功能亢進(jìn)癥患者組血清鋅水平較健康對(duì)照組高，差別有意義。檢測(cè)了30例腎小球源性血尿患者及82例健康對(duì)照者尿鋅濃度、尿鋅/尿肌酐比值，發(fā)現(xiàn)腎小球源性血尿組尿鋅濃度、尿鋅/尿肌酐比值高于健康對(duì)照組，差異有意義。對(duì)42例兒童血鋅、

8、發(fā)鋅、尿鋅濃度進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三指標(biāo)間無相關(guān)性。 結(jié)論 1.我們建立的碳酸酐酶法測(cè)定生物樣品中鋅含量的方法，克服了化學(xué)比色法測(cè)定鋅所具有的試劑空白吸光度高、干擾因素多、準(zhǔn)確度差以及水合氯醛、氰化鉀等試劑具有毒害性等方法學(xué)缺陷，具有操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。各項(xiàng)方法學(xué)性能均達(dá)到所規(guī)定的要求，適合于自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。血清、發(fā)樣、尿液經(jīng)預(yù)處理后均可采用此法測(cè)鋅。 2.用我們建立的方