機械應力誘導頸椎后縱韌帶骨化進展過程中成纖維細胞的蛋白組學研究.pdf

1、目的：頸椎后縱韌帶骨化（ossification of cervicAlposterior longitudinAlligament,OPLL）是以頸椎后縱韌帶異位骨化為特點的一種疾病，在骨化過程中伴隨著脊髓和神經受壓，導致患者出現(xiàn)四肢感覺運動及大小便功能障礙等臨床癥狀，嚴重的影響患者的生活質量，在以日本為首的亞洲國家中具有較高發(fā)病率，其具體的發(fā)病機制目前并不完全清楚。最新臨床研究發(fā)現(xiàn)，OPLL患者行頸椎后路椎管成形術或者后路椎板切除術

2、后，頸椎穩(wěn)定性下降，活動度增加，隨訪期間發(fā)現(xiàn)患者的骨化進展速度較未手術患者明顯加快；而OPLL患者行前路減壓融合術后，因為病變節(jié)段活動度消失，骨化進展明顯減慢或完全消失。同時，機械應力刺激因素在動物實驗得到進一步證實：
　　 對大鼠尾端椎體進行牽張應力刺激2周后即發(fā)現(xiàn)大鼠近端椎體韌帶出現(xiàn)明顯骨化傾向。因此，可以肯定局部機械應力刺激是促進韌帶異位骨化發(fā)生、發(fā)展的一個極其重要的環(huán)境因素。蛋白質組學（Proteomics）的概念自20

3、世紀90年代后期提出以后，作為后基因組學時代的研究工具，在蛋白質組表達、蛋白質功能研究中發(fā)揮越來越大的作用，對發(fā)現(xiàn)疾病標志物、藥物靶點的確證等方面有著十分重要的意義。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE在技術上的改進，該技術結合了多重熒光分析的方法，通過花青染料的熒光素蛋白質中的賴氨酸殘基進行結合，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，并第一次引入內標的概念。該技術可以使樣本間的差異蛋白質點顯示更加容易、更加準確，可以發(fā)現(xiàn)更

4、多表達差異的蛋白質點。隨后利用MALDI-TOF/TOF MS 質譜技術以及膚質量圖譜(pePtidemassfingerprint，PMF)等多種數(shù)據的組合來確定可靠的蛋白質。本研究采用蛋白組學研究方法，通過熒光差異凝膠電泳（differentiAlgel electrophoresis, DIGE）及質譜技術篩選并鑒定頸椎后縱韌帶成纖維細胞在機械應力誘導骨向分化過程中表達差異的蛋白質，并通過生物信息學分析，獲得蛋白質水平上關于疾病發(fā)

5、生過程的整體而全面的認識，分析多個細胞內信號傳導途徑在疾病發(fā)生過程中所起的作用，期望找到機械應力在頸椎后縱韌帶骨化發(fā)生、發(fā)展過程中相關的細胞信號分子蛋白，探討力學刺激在頸椎后縱韌帶骨化發(fā)展過程中的可能的病理學和分子機制，為臨床OPLL的治療提供可能的藥物靶點。
　　 方法：我院骨科從2009年3月至2010年4月共收治12例頸椎后縱韌帶骨化患者，全部病例行頸椎前路椎體次全切除減壓、植骨融合內固定術，術中獲得患者后縱韌帶組織，另外

6、收集10例非骨化患者的頸椎后縱韌帶骨化組織（頸椎病2例，頸椎外傷8例），采用組織塊貼壁法培養(yǎng)、鑒定骨化與非骨化后縱韌帶成纖維細胞。將傳至第3代的成纖維細胞（骨化組與非骨化組）接種于6孔培養(yǎng)板內，貼壁后同步化24小時，采用Flexercell4000應力加載系統(tǒng)對細胞施加10％-0.5 Hz的機械應力，持續(xù)加載24小時，以同樣種于Flexercell 板未施加機械應力為對照組（骨化組與非骨化組），采用半定量RT-PCR 技術檢測機械應力誘

7、導前后三個成骨特異指標骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）及I 型膠原（COL I）表達量的差異，明確成纖維細胞經機械應力誘導后有無發(fā)生骨向分化。DIGE 裂解液、超聲破碎抽提骨化組細胞的總蛋白質樣本，普通2-DE 雙向凝膠電泳分離，染色鑒定成纖維細胞蛋白質樣本的量及確定電泳條件是否滿意。然后加大上樣量，以Cy2、Cy3及Cy5 熒光素標記機械應力誘導前后的成纖維細胞蛋白樣品各50μg，以所有樣本的混合物50μg作為內參，進行雙向熒光

8、差異凝膠電泳（DIGE）。獲得熒光差異表達圖譜，利用DeCyder6.5 圖譜軟件進行膠內及生物學差異分析，確定差異表達的蛋白質點。挑取差異表達的蛋白點，手工切膠后酶解以獲得肽段樣本。采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrum,MALDI-TOF/TOF MS）進行鑒定并分析差異表達的蛋白質點。

9、查閱相關參考文獻，總結分析相關表達差異蛋白質的分子量、功能及細胞內的分布，推測其在OPLL 進程中的可能作用及機制。選擇有深入研究價值的蛋白-波形蛋白，采用Western Blotting技術從蛋白水平進一步驗證DIGE和質譜技術篩選出來差異蛋白質表達水平差異的準確性。然后利用RNAi 干擾技術，阻斷波形蛋白的表達，再采用半定量RT-PCR 技術檢測機械應力誘導前后三個成骨特異性指標骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）及I 型膠原（C

10、OL I）表達量的差異，進一步驗證波形蛋白是否在OPLL 韌帶成纖維細胞骨化進程中的重要作用，深入探討其在力學因素誘導OPLL 骨化中可能的分子機制。
　　 結果：利用組織貼壁法成功的培養(yǎng)了骨化與非骨化頸椎后縱韌帶成纖維細胞，經鑒定確認細胞為成纖維細胞。機械牽張應力可誘導來源于頸椎頸椎后縱韌帶骨化患者的韌帶組織成纖維細胞發(fā)生骨向分化，RT-PCR確認成纖維細胞經機械應力誘導后成骨特異性標記物OCN、ALP、COL I表達量明顯增

11、高，而對于來源于非骨化患者的頸椎后縱韌帶組織成纖維細胞卻無相應作用，誘導前后OCN、ALP、COL I未見明顯變化。提取骨化組后縱韌帶成纖維細胞牽拉組和對照組細胞的總蛋白，然后行普通2-D電泳實驗，染色后得到的圖譜顯示蛋白質豐度、分離情況及電泳條件滿意。熒光差異雙向凝膠電泳（DIGE）獲得的熒光膠圖，膠間比較共篩選出34個差異表達蛋白質點，其中 4個蛋白質在表達上調， 30個蛋白質點下調；最大上調比例為1.58倍；最大下調比例為5.47

12、倍。選擇的標準為豐度具有顯著性改變（比值>1.2倍，P<0.05)的蛋白質點被從考染的制備膠上切下用于質譜分析。手工切膠獲得蛋白質點的肽段樣本，采用MALDI-TOF/TOF MS質譜技術成功鑒定了15個表達差異的蛋白，其中14個表達下調，1個表達上調。查閱相關文獻，根據這些蛋白質的功能分為以下幾類：代謝酶類、蛋白質翻譯相關蛋白、細胞骨架蛋白和其它相關蛋白。多種蛋白質發(fā)現(xiàn)與骨化相關，選擇可能在OPLL發(fā)生和發(fā)展過程中起關鍵作用的蛋白-波

13、形蛋白（Vimentin）行進一步驗證，通過Western blotting技術驗證了DIGE的實驗結果，并通過RNAi實驗進一步驗證了其在OPLL韌帶成纖維細胞骨化進程中的重要作用。
　　 結論：組織塊培養(yǎng)法可成功進行頸椎后縱韌帶成纖維細胞的培養(yǎng)。機械應力刺激誘導OPLL組后縱韌帶成纖維細胞后OCN、ALP及COL I的高表達說明機械應力刺激在后縱韌帶骨化進展過程中的促進作用。通過DIGE及質譜技術篩選并鑒定成纖維細胞在機械應