機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)頸椎后縱韌帶骨化進(jìn)展過程中成纖維細(xì)胞的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、目的：頸椎后縱韌帶骨化（ossification of cervicAlposterior longitudinAlligament,OPLL）是以頸椎后縱韌帶異位骨化為特點(diǎn)的一種疾病，在骨化過程中伴隨著脊髓和神經(jīng)受壓，導(dǎo)致患者出現(xiàn)四肢感覺運(yùn)動(dòng)及大小便功能障礙等臨床癥狀，嚴(yán)重的影響患者的生活質(zhì)量，在以日本為首的亞洲國家中具有較高發(fā)病率，其具體的發(fā)病機(jī)制目前并不完全清楚。最新臨床研究發(fā)現(xiàn)，OPLL患者行頸椎后路椎管成形術(shù)或者后路椎板切除術(shù)

2、后，頸椎穩(wěn)定性下降，活動(dòng)度增加，隨訪期間發(fā)現(xiàn)患者的骨化進(jìn)展速度較未手術(shù)患者明顯加快；而OPLL患者行前路減壓融合術(shù)后，因?yàn)椴∽児?jié)段活動(dòng)度消失，骨化進(jìn)展明顯減慢或完全消失。同時(shí)，機(jī)械應(yīng)力刺激因素在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步證實(shí)：
　　 對大鼠尾端椎體進(jìn)行牽張應(yīng)力刺激2周后即發(fā)現(xiàn)大鼠近端椎體韌帶出現(xiàn)明顯骨化傾向。因此，可以肯定局部機(jī)械應(yīng)力刺激是促進(jìn)韌帶異位骨化發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)極其重要的環(huán)境因素。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）的概念自20

3、世紀(jì)90年代后期提出以后，作為后基因組學(xué)時(shí)代的研究工具，在蛋白質(zhì)組表達(dá)、蛋白質(zhì)功能研究中發(fā)揮越來越大的作用，對發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志物、藥物靶點(diǎn)的確證等方面有著十分重要的意義。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE在技術(shù)上的改進(jìn)，該技術(shù)結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?，通過花青染料的熒光素蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基進(jìn)行結(jié)合，在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，并第一次引入內(nèi)標(biāo)的概念。該技術(shù)可以使樣本間的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)顯示更加容易、更加準(zhǔn)確，可以發(fā)現(xiàn)更

4、多表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)。隨后利用MALDI-TOF/TOF MS 質(zhì)譜技術(shù)以及膚質(zhì)量圖譜(pePtidemassfingerprint，PMF)等多種數(shù)據(jù)的組合來確定可靠的蛋白質(zhì)。本研究采用蛋白組學(xué)研究方法，通過熒光差異凝膠電泳（differentiAlgel electrophoresis, DIGE）及質(zhì)譜技術(shù)篩選并鑒定頸椎后縱韌帶成纖維細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)骨向分化過程中表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，并通過生物信息學(xué)分析，獲得蛋白質(zhì)水平上關(guān)于疾病發(fā)

5、生過程的整體而全面的認(rèn)識，分析多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑在疾病發(fā)生過程中所起的作用，期望找到機(jī)械應(yīng)力在頸椎后縱韌帶骨化發(fā)生、發(fā)展過程中相關(guān)的細(xì)胞信號分子蛋白，探討力學(xué)刺激在頸椎后縱韌帶骨化發(fā)展過程中的可能的病理學(xué)和分子機(jī)制，為臨床OPLL的治療提供可能的藥物靶點(diǎn)。
　　 方法：我院骨科從2009年3月至2010年4月共收治12例頸椎后縱韌帶骨化患者，全部病例行頸椎前路椎體次全切除減壓、植骨融合內(nèi)固定術(shù)，術(shù)中獲得患者后縱韌帶組織，另外

6、收集10例非骨化患者的頸椎后縱韌帶骨化組織（頸椎病2例，頸椎外傷8例），采用組織塊貼壁法培養(yǎng)、鑒定骨化與非骨化后縱韌帶成纖維細(xì)胞。將傳至第3代的成纖維細(xì)胞（骨化組與非骨化組）接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，貼壁后同步化24小時(shí)，采用Flexercell4000應(yīng)力加載系統(tǒng)對細(xì)胞施加10％-0.5 Hz的機(jī)械應(yīng)力，持續(xù)加載24小時(shí)，以同樣種于Flexercell 板未施加機(jī)械應(yīng)力為對照組（骨化組與非骨化組），采用半定量RT-PCR 技術(shù)檢測機(jī)械應(yīng)力誘

7、導(dǎo)前后三個(gè)成骨特異指標(biāo)骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）及I 型膠原（COL I）表達(dá)量的差異，明確成纖維細(xì)胞經(jīng)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)后有無發(fā)生骨向分化。DIGE 裂解液、超聲破碎抽提骨化組細(xì)胞的總蛋白質(zhì)樣本，普通2-DE 雙向凝膠電泳分離，染色鑒定成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)樣本的量及確定電泳條件是否滿意。然后加大上樣量，以Cy2、Cy3及Cy5 熒光素標(biāo)記機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)前后的成纖維細(xì)胞蛋白樣品各50μg，以所有樣本的混合物50μg作為內(nèi)參，進(jìn)行雙向熒光

8、差異凝膠電泳（DIGE）。獲得熒光差異表達(dá)圖譜，利用DeCyder6.5 圖譜軟件進(jìn)行膠內(nèi)及生物學(xué)差異分析，確定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。挑取差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，手工切膠后酶解以獲得肽段樣本。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrum,MALDI-TOF/TOF MS）進(jìn)行鑒定并分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。

9、查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)，總結(jié)分析相關(guān)表達(dá)差異蛋白質(zhì)的分子量、功能及細(xì)胞內(nèi)的分布，推測其在OPLL 進(jìn)程中的可能作用及機(jī)制。選擇有深入研究價(jià)值的蛋白-波形蛋白，采用Western Blotting技術(shù)從蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證DIGE和質(zhì)譜技術(shù)篩選出來差異蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異的準(zhǔn)確性。然后利用RNAi 干擾技術(shù)，阻斷波形蛋白的表達(dá)，再采用半定量RT-PCR 技術(shù)檢測機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)前后三個(gè)成骨特異性指標(biāo)骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）及I 型膠原（C

10、OL I）表達(dá)量的差異，進(jìn)一步驗(yàn)證波形蛋白是否在OPLL 韌帶成纖維細(xì)胞骨化進(jìn)程中的重要作用，深入探討其在力學(xué)因素誘導(dǎo)OPLL 骨化中可能的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：利用組織貼壁法成功的培養(yǎng)了骨化與非骨化頸椎后縱韌帶成纖維細(xì)胞，經(jīng)鑒定確認(rèn)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。機(jī)械牽張應(yīng)力可誘導(dǎo)來源于頸椎頸椎后縱韌帶骨化患者的韌帶組織成纖維細(xì)胞發(fā)生骨向分化，RT-PCR確認(rèn)成纖維細(xì)胞經(jīng)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)后成骨特異性標(biāo)記物OCN、ALP、COL I表達(dá)量明顯增

11、高，而對于來源于非骨化患者的頸椎后縱韌帶組織成纖維細(xì)胞卻無相應(yīng)作用，誘導(dǎo)前后OCN、ALP、COL I未見明顯變化。提取骨化組后縱韌帶成纖維細(xì)胞牽拉組和對照組細(xì)胞的總蛋白，然后行普通2-D電泳實(shí)驗(yàn)，染色后得到的圖譜顯示蛋白質(zhì)豐度、分離情況及電泳條件滿意。熒光差異雙向凝膠電泳（DIGE）獲得的熒光膠圖，膠間比較共篩選出34個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中 4個(gè)蛋白質(zhì)在表達(dá)上調(diào)， 30個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)；最大上調(diào)比例為1.58倍；最大下調(diào)比例為5.47

12、倍。選擇的標(biāo)準(zhǔn)為豐度具有顯著性改變（比值>1.2倍，P<0.05)的蛋白質(zhì)點(diǎn)被從考染的制備膠上切下用于質(zhì)譜分析。手工切膠獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽段樣本，采用MALDI-TOF/TOF MS質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定了15個(gè)表達(dá)差異的蛋白，其中14個(gè)表達(dá)下調(diào)，1個(gè)表達(dá)上調(diào)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)這些蛋白質(zhì)的功能分為以下幾類：代謝酶類、蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白和其它相關(guān)蛋白。多種蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)與骨化相關(guān)，選擇可能在OPLL發(fā)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的蛋白-波

13、形蛋白（Vimentin）行進(jìn)一步驗(yàn)證，通過Western blotting技術(shù)驗(yàn)證了DIGE的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并通過RNAi實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了其在OPLL韌帶成纖維細(xì)胞骨化進(jìn)程中的重要作用。
　　 結(jié)論：組織塊培養(yǎng)法可成功進(jìn)行頸椎后縱韌帶成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。機(jī)械應(yīng)力刺激誘導(dǎo)OPLL組后縱韌帶成纖維細(xì)胞后OCN、ALP及COL I的高表達(dá)說明機(jī)械應(yīng)力刺激在后縱韌帶骨化進(jìn)展過程中的促進(jìn)作用。通過DIGE及質(zhì)譜技術(shù)篩選并鑒定成纖維細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)