Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并促進(jìn)其成骨分化的研究.pdf

1、背景：大面積骨缺損一直是創(chuàng)傷骨科的治療難題。自體骨、異體骨，以及人工骨材料的填充都難以有效治療大面積的骨缺損。骨組織工程通過(guò)整合支架材料、種子細(xì)胞、活性因子等提高人工骨材料的成骨活性，達(dá)到修復(fù)大面積骨缺損的目的。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，在骨修復(fù)與重建中可分化為成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞，繼而促進(jìn)骨愈合。Runx2在成骨分化的信號(hào)途徑中起核心作用，能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化并成熟，從而促進(jìn)骨修復(fù)。
　　目的：本次實(shí)驗(yàn)利

2、用重組Runx2基因的慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使Runx2基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)水平增高，檢測(cè)其成骨相關(guān)基因表達(dá)的水平，觀察Runx2基因促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的情況。
　　方法：從骨肉瘤細(xì)胞系(MG-63)中抽提總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增Runx2基因，通過(guò)酶切與連接的方法把Runx2基因連接到慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒Pez-lv201。然后和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒的包裝，以熒光法行慢病毒滴度測(cè)定。<

3、br>　　取4周齡SD大鼠脛骨，用全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性表面標(biāo)記物CD90和CD105，驗(yàn)證培養(yǎng)細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最佳感染復(fù)數(shù)為50。將Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過(guò)鏡下觀察，RT-PCR檢測(cè)成骨基因的表達(dá)情況，驗(yàn)證Runx2重組慢病毒促進(jìn)BMSCs的成骨分化。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)反轉(zhuǎn)錄成功獲得目的基因Runx2基因。Runx2

4、基因與表達(dá)載體質(zhì)粒連接后，經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序鑒定正確。
　　2.熒光鏡下觀察，A組（含0.1μl病毒液）、B組（含0.5μl病毒液）、C組（含2.0μl病毒液）、D組（含10μl病毒液）、E組（含50μl病毒液）平均每視野范圍內(nèi)熒光細(xì)胞數(shù)分別為2個(gè)、8個(gè)、27個(gè)、163個(gè)、721個(gè)，經(jīng)計(jì)算A、B、C、D、E的病毒液滴度分別為：2*109TU/ml、1.6*109 TU/ml、1.35*109 TU/ml、1.63*109 TU/ml、

5、1.45*109 TU/ml，取平均數(shù)，可得到慢病毒液滴度為1.6*109 TU/ml。F組（空載對(duì)照組）未發(fā)現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞。
　　3.鏡下觀察第三代培養(yǎng)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、紡錘形及多角形貼壁生長(zhǎng)，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)特征。流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性表面標(biāo)記物CD90和CD105，表達(dá)率分別為99.8％、99.3%。說(shuō)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)成功。
　　4.慢病毒感染BMSCs后，實(shí)驗(yàn)組（BMSCs-Runx2）細(xì)胞胞

6、體變大，呈多角形、鱗片形，胞漿變多，細(xì)胞核增大，可有多核；而對(duì)照組（control BMSCs）細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯改變，說(shuō)明Runx2重組慢病毒促BMSC成骨分化。
　　5.實(shí)驗(yàn)組（BMSCs-Runx2）Runx2、OCN、osteonectin、ALP、BMP-2、OPN等成骨特異性基因的表達(dá)水平隨時(shí)間推移而增高，在第14天時(shí)達(dá)到最高；其中BMP-2表達(dá)最強(qiáng)；對(duì)照組（BMSCs）上述基因無(wú)表達(dá)。說(shuō)明Runx2重組慢病毒可使骨髓間