P-選擇素介導(dǎo)血小板粘附對(duì)腫瘤的作用.pdf

1、背景與目的：早在半個(gè)多世紀(jì)之前，臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，減少血小板可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。但是血小板減少引起出血而限制其臨床應(yīng)用?；罨难“搴脱軆?nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-選擇素，參與血小板粘附于腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。P-選擇素對(duì)腫瘤的作用如何？P-選擇素是否可以通過(guò)介導(dǎo)血小板－腫瘤細(xì)胞的相互作用影響腫瘤的生長(zhǎng)，目前尚不清楚。血清淀粉樣P蛋白（SAP）和C-反應(yīng)蛋白（CRP）是一類具有鈣依賴結(jié)合活性的血漿蛋白，在急性

2、炎癥反應(yīng)中會(huì)急劇上調(diào)表達(dá)，其中SAP主要在小鼠炎癥中上調(diào)，而人體炎癥中主要是CRP上調(diào)。耿建國(guó)教授課題組從人血小板中共沉淀一種分子量約為28kDa的糖蛋白，并證實(shí)該蛋白為SAP，通過(guò)體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)SAP可以特異性和P-選擇素結(jié)合，并抑制P-選擇素介導(dǎo)細(xì)胞粘附和炎癥反應(yīng)。那么SAP能否抑制P-選擇素介導(dǎo)的血小板粘附對(duì)腫瘤作用呢？本研究擬全面探討P-選擇素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，P-選擇素介導(dǎo)的血小板粘附于腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用，以及SA

3、P能否抑制P-選擇素介導(dǎo)的血小板粘附對(duì)腫瘤的作用。 方法： 1、P-選擇素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用采用P-選擇素敲除小鼠和C57小鼠，皮下接種B16黑色素瘤細(xì)胞，建立皮下移植瘤模型，通過(guò)測(cè)量腫瘤體積及記錄小鼠的生存期，探討P-選擇素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。通過(guò)Rip1-Tag2小鼠與P-選擇素敲除小鼠雜交，建立PKO/Rip1-Tag2小鼠胰島β細(xì)胞瘤自發(fā)生長(zhǎng)模型，并設(shè)PKO/Rip1-Tag2小鼠為實(shí)驗(yàn)組，而Rip1-Tag2小鼠為

4、對(duì)照組。通過(guò)計(jì)數(shù)血性胰島、胰島β細(xì)胞瘤數(shù)目，以及測(cè)量腫瘤的體積，探討P-選擇素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。用免疫組化技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中與腫瘤增殖、凋亡、血管相關(guān)的標(biāo)記性分子如Brdu、MDV、Tunel等，分析P-selectin對(duì)腫瘤增殖、凋亡及血管形成的影響。 2、P-選擇素對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用分別給P-選擇素敲除小鼠和C57小鼠尾靜脈注射B16黑色素瘤細(xì)胞，建立轉(zhuǎn)移瘤模型，通過(guò)記錄轉(zhuǎn)移到肺及肝表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目，觀察P-選擇素對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移

5、的作用。 3、血小板對(duì)Rip1-Tag2小鼠胰島β細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)的作用通過(guò)給Rip1-Tag2小鼠注射抗血小板抗體GPIbalpha 抗體（實(shí)驗(yàn)組）及其對(duì)照抗體（對(duì)照組），造成實(shí)驗(yàn)鼠的低血小板血癥，通過(guò)計(jì)數(shù)Rip1-Tag2小鼠的血性胰島和胰島β細(xì)胞瘤數(shù)目，并測(cè)量腫瘤體積，來(lái)觀察血小板對(duì)Rip1-Tag2小鼠胰島β細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)的作用。 4、血小板在小鼠腫瘤中的分布特征分離PKO/ Rip1-Tag2和Rip1-Tag2小鼠

6、胰腺，冰凍切片后，用免疫熒光（IF）方法檢測(cè)血小板標(biāo)記性分子CD41的表達(dá)，分析血小板在小鼠腫瘤中的分布。 5、P-選擇素介導(dǎo)血小板粘附對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用為了研究P-選擇素介導(dǎo)血小板粘附對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用，分離P-選擇素敲除小鼠（實(shí)驗(yàn)組）或C57小鼠（對(duì)照組）的血小板后，回輸給PKO/Rip1-Tag2小鼠，然后計(jì)數(shù)小鼠的腫瘤和血性胰島的數(shù)目及測(cè)量腫瘤體積，并檢測(cè)CD41的表達(dá)。觀察表達(dá)P-選凝素的血小板和P-選擇素敲除的血小板對(duì)腫

7、瘤生長(zhǎng)的影響。 6、用基因工程小鼠，研究SAP是否抑制P-選擇素介導(dǎo)血小板粘附對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用用SAP-Tg小鼠與Rip1-Tag2小鼠雜交，建立SAP過(guò)表達(dá)的自發(fā)胰島β細(xì)胞瘤小鼠模型（SAP-Tg/ Rip1-Tag2 小鼠模型），并以SAP-Tg / Rip1-Tag2小鼠為實(shí)驗(yàn)組，而Rip1-Tag2小鼠為對(duì)照組。通過(guò)計(jì)數(shù)血性胰島、胰島β細(xì)胞瘤數(shù)目，以及測(cè)量腫瘤的體積，探討SAP抑制P-選擇素介導(dǎo)血小板粘附對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用

8、。 結(jié)果： 1、建立的皮下移植瘤模型結(jié)果顯示P-選擇素敲除小鼠的腫瘤體積明顯小于C57小鼠皮下移植瘤的體積，生存期也明顯比C57小鼠長(zhǎng)。而且PKO/ Rip1-Tag2小鼠血性胰島的數(shù)目和腫瘤數(shù)目明顯少于Rip1-Tag2小鼠，腫瘤體積也明顯減小，PKO/Rip1-Tag2的生存期也明顯比Rip1-Tag2長(zhǎng)。免疫組化結(jié)果顯示PKO/Rip1-Tag2小鼠腫瘤血管的密度及胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞的Brdu增殖數(shù)目明顯少于Rip1

9、-Tag2小鼠，同時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于Rip1-Tag2小鼠。 2、轉(zhuǎn)移瘤模型結(jié)果表明P-選擇素敲除小鼠轉(zhuǎn)移到肺臟及肝臟的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于C57小鼠。 3、為Rip1-Tag2 小鼠注射抗血小板抗體GPIbalpha 抗體及對(duì)照抗體后，發(fā)現(xiàn)Rip1-Tag2 小鼠血小板水平降低后腫瘤體積明顯減少，但是腫瘤數(shù)目及血性胰島數(shù)目沒(méi)有明顯變化。 4、用免疫熒光法檢測(cè)PKO/Rip1-Tag2小鼠和Rip1-Tag2小鼠

10、胰腺中血小板標(biāo)記性分子CD41表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PKO/Rip1-Tag2小鼠胰島β細(xì)胞瘤組織中聚集的血小板明顯少于Rip1-Tag2小鼠。 5、通過(guò)給8周、10周時(shí)的PKO/Rip1-Tag2小鼠回輸P-選擇素敲除小鼠（實(shí)驗(yàn)組）和C57小鼠的（對(duì)照組）血小板發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤數(shù)目和腫瘤體積明顯少于對(duì)照組小鼠，但6周開(kāi)始回輸血小板的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的腫瘤數(shù)目及腫瘤體積沒(méi)有顯著差異。 6、建立SAP-Tg/Rip1-Tag2

11、小鼠模型發(fā)現(xiàn)，SAP-Tg/Rip1-Tag2小鼠的血性胰島數(shù)目和腫瘤數(shù)目明顯少于Rip1-Tag2小鼠，腫瘤體積也明顯小于Rip1-Tag2小鼠。 結(jié)論： 1、P-選擇素敲除抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。 2、P-選擇素敲除抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。 3、血小板促進(jìn)了Rip1-Tag2小鼠胰島β細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)。 4、P-選擇素通過(guò)介導(dǎo)血小板粘附于胰島β細(xì)胞瘤促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)。 5、SAP抑制了P-選擇素介導(dǎo)血