ApoA-I介導(dǎo)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出過程中的相關(guān)分子鑒定.pdf

1、[目的]
　　 在動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)發(fā)生發(fā)展過程中，泡沫細(xì)胞的形成是早期關(guān)鍵性事件。巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞形成是動脈粥樣損傷形成的特征表現(xiàn)。促使膽固醇從巨噬細(xì)胞中外流對阻止泡沫細(xì)胞形成以及防止動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。膽固醇以囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行分泌已經(jīng)得到公認(rèn)，而在此過程中有高密度載脂蛋白-Ⅰ(apolipoprotein，apoA-Ⅰ)的介導(dǎo)，SCAMP2和YKT6是囊泡分泌蛋白，參與囊

2、泡分泌轉(zhuǎn)運(yùn)，那么在apoA-Ⅰ介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出過程中是否有這兩種蛋白的參與，目前未見報道。本研究首先建立巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型，采用高效液相色譜(HPLC)檢測apoA-Ⅰ介導(dǎo)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的變化，在此基礎(chǔ)上分析在apoA-Ⅰ介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出過程中，SCAMP2和YKT6表達(dá)的變化，鑒定在此途徑中是否有SCAMP2和YKT6參與。
　　 [方法]
　　 1.人單核THP-1細(xì)胞用含10

3、％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，佛波酯(PMA)誘導(dǎo)人單核THP-1細(xì)胞，使其分化為巨噬細(xì)胞，然后加入乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)，使巨噬細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞，建立巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。
　　 2.巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛固定，油紅O染色，加蘇木精復(fù)染，于相差顯微鏡下觀察，對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型進(jìn)行簽定。
　　 3.細(xì)胞分為巨噬細(xì)胞組、泡沫細(xì)胞組和加apoA-Ⅰ處理的泡沫細(xì)胞組，分別收集

4、各組細(xì)胞和培養(yǎng)基，并分別提取膽固醇，以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品為對照，高效液相色譜法(HPLC)檢測各組的膽固醇含量，計算膽固醇流出率。
　　 4.細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)成泡沫細(xì)胞后，根據(jù)SCAMP2和YKT6基因在GenBank中的序列設(shè)計、合成引物，通過RT-PCR半定量和Real-time PCR定量方法，分別分析巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和apoA-Ⅰ處理的泡沫細(xì)胞中SCAMP2和YKT6基因表達(dá)。
　　 5.Western blotting

5、方法分析巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和加apoA-Ⅰ處理的泡沫細(xì)胞中SCAMP2和YKT6蛋白表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 1.經(jīng)油紅O染色鑒定，成功建立了巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。
　　 2.高效液相色譜法(HPLC)檢測顯示，加入apoA-Ⅰ介導(dǎo)了泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，其流出率變化為5.9％。
　　 3.RT-PCR、Real-time PCR分析表明，與對照泡沫細(xì)胞相比，加入apoA-Ⅰ后泡沫細(xì)胞內(nèi)SCAM

6、P2基因表達(dá)量分別增加1.18倍和1.7倍；YKT6基因表達(dá)量分別增加1.2倍和1.9倍。
　　 4.Western blotting分析證實了在apoA-Ⅰ介導(dǎo)泡沫細(xì)胞膽固醇流出過程中，與acLDL組相比，SCAMP2和YKT6蛋白表達(dá)量分別增加1.2倍和1.6倍。
　　 [結(jié)論]
　　 在apoA-Ⅰ介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出過程中，囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SCAMP2和YKT6基因和蛋白表達(dá)都有升高，首次證實了囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)