D4-F對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)及膽固醇流出的影響.pdf

1、目的：三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A（ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1）在細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出中具有重要的作用。載脂蛋白A-1模擬肽D4-F是含有18氨基酸殘基的小分子肽，其α-兩性螺旋基序是與脂質(zhì)結(jié)合重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，D4-F具有抗炎抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，在D4-F喂養(yǎng)的小鼠血液中，其三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平較正常組降低。在細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)D4-F能夠上調(diào)ABCA1蛋白

2、質(zhì)水平，但其具體的機(jī)制不清楚。
　　Cdc42是RhoGTP酶超家族成員，分子量為25KD。有研究表明Cdc42參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出。丹吉爾病患者的成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中Cdc42表達(dá)下調(diào)。apoA-1與ABCA1結(jié)合后，能夠活化Cdc42。而本實(shí)驗(yàn)組研究已經(jīng)證實(shí)apoA-1通過cAMP/PKA信號(hào)途徑影響ABCA1蛋白質(zhì)的表達(dá)及其介導(dǎo)的膽固醇的流出?；谶@些研究，我們以THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞為模型，探討D4-F對(duì)ABC

3、A1表達(dá)及其介導(dǎo)的膽固醇的影響，并進(jìn)一步觀察Cdc42/cAMP/PKA是否在這個(gè)過程中起作用。
　　第一部分 D4-F對(duì)ABCA1表達(dá)及其介導(dǎo)的膽固醇流出的影響
　　目的: D4-F作為apoA-1的模擬肽，它是否影響THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中ABCA1表達(dá)及其介導(dǎo)的膽固醇流出？故本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察D4-F對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中ABCA1表達(dá)及其介導(dǎo)的膽固醇流出的影響。
　　方法: THP-1單核細(xì)

4、胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)貼壁后，加入oxLDL誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞后，1.不同濃度（0μg/ml﹑2μg/ml﹑4μg/ml﹑6μg/ml）D4-F處理細(xì)胞24小時(shí);2.6μg/ml D4-F處理細(xì)胞不同時(shí)間（0﹑6﹑12﹑24小時(shí)）和5μg/ml BSA處理細(xì)胞24小時(shí)；3.6μg/ml D4-F與20μg/ml D4-F放線菌酮共處理細(xì)胞0，1，2小時(shí)。實(shí)時(shí)定量PCR和Western印跡分析法分別檢測(cè)ABCA1 mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)；液體閃

5、爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，高效液相色譜分析細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯含量。
　　結(jié)果: D4-F不影響ABCA1m RNA水平；6μg/ml D4-F和D4-F處理細(xì)胞24小時(shí)， ABCA1蛋白質(zhì)的表達(dá)至高峰；加入放線菌酮抑制蛋白質(zhì)合成之后，D4-F能夠明顯減緩ABCA1蛋白質(zhì)的降解；高效液相色譜法顯示D4-F降低了細(xì)胞內(nèi)總膽固醇，游離膽固醇和膽固醇酯的含量。液體閃爍法檢測(cè)D4-F能夠濃度依賴性和時(shí)間依賴性提高細(xì)胞內(nèi)

6、膽固醇及其磷脂的流出。
　　第二部分 D4-F增加ABCA1表達(dá)及其介導(dǎo)膽固醇流出的機(jī)制探討
　　目的:前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示D4-F增加ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)及其介導(dǎo)的膽固醇流出，故本實(shí)驗(yàn)主要探討D4-F影響ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)及其介導(dǎo)膽固醇流出的可能機(jī)制。
　　方法: THP-1單核細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)貼壁后，加入oxLDL誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，1.6μg/ml D4-F處理細(xì)胞0，15，20，25分鐘后，觀察PKA活性；2.

7、轉(zhuǎn)染PKA-siRNA后，6μg/ml D4-F孵育24小時(shí)；3.1.0mM PKA特異性激動(dòng)劑dBcAMP與6μg/ml D4-F孵育24小時(shí)；4.20μg/ml D4-F放線菌酮與PKA-siRNA干擾或dBcAMP和6μg/ml D4-F處理細(xì)胞0，1，2小時(shí)；5.6μg/ml和100μg/l腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536或25mM Cdc42抑制劑Scramine B在37℃孵育30分鐘；6.6μg/ml D4-F處理細(xì)胞0，

8、10，15，20分鐘后，觀察Cdc42活性。吸光度值檢測(cè)PKA活性和Cdc42活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Cdc42活性；液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出；Western印跡分析法檢測(cè)ABCA1蛋白質(zhì)的表達(dá)和ABCA1磷酸化；酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)cAMP水平。
　　結(jié)果: D4-F激活PKA；PKA-siRNA能下調(diào)PKA蛋白質(zhì)的表達(dá)，與對(duì)照組比較表達(dá)下調(diào)達(dá)85％；PKA-siRNA和dBcAMP均不影響D4-F增加ABCA1蛋白質(zhì)的作用；

9、PKA-siRNA，dBcAMP，SQ22536均能逆轉(zhuǎn)D4-F引起的ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出增加；同時(shí)，SQ22536能逆轉(zhuǎn)D4-F引起的cAMP水平，PKA活性及ABCA1磷酸化的增加；D4-F能影響Cdc42活性；Scramine B影響了D4-F引起的cAMP水平和PKA活性增加。
　　結(jié)論：
　　1 D4-F呈時(shí)間和濃度依賴上調(diào)ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)；
　　2 D4-F可以通過Cdc42/cAMP/PKA途徑