炎癥引起膽固醇敏感器SCAP功能失調(diào)致泡沫細胞形成的分子機制.pdf

1、目的:細胞內(nèi)膽固醇主要來源于兩個方面，即外源性膽固醇攝入和內(nèi)源性膽固醇合成，它們均通過一個依賴于細胞內(nèi)膽固醇水平的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的嚴密控制來保證膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，即主要通過SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA reductase通路實現(xiàn)對細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。過去的研究中，我們已經(jīng)證實炎癥可以通過干擾膽固醇介導的LDLr負反饋調(diào)節(jié)來促進外周細胞，如血管平滑肌細胞（VSMCs）及腎小球系膜細胞（HMCs）的膽固醇攝入，同時下

2、調(diào)ABCA1基因表達來減少膽固醇外流，從而導致膽固醇在外周細胞異常堆積形成泡沫細胞。本研究在過去研究的基礎(chǔ)上，選用人THP-1巨噬細胞和VSMCs細胞，①探討炎癥是否干擾巨噬細胞內(nèi)LDLr負反饋調(diào)控，從而導致巨噬細胞大量攝入天然LDL形成泡沫細胞；②探討炎癥導致VSMCs細胞內(nèi)膽固醇敏感器SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常逃逸到高爾基體的分子機制；⑧比較生理條件及炎癥狀態(tài)下，巨噬細胞和VSMCs細胞LDLr負反饋調(diào)控的差異。 材料和方法:用酶

3、學法分別檢測THP-1巨噬細胞和VSMCs細胞內(nèi)總膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）和膽固醇酯（CE）的水平；油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況；提取細胞總RNA，應用實時熒光定量PCR技術(shù)（real-time quantitative PCR）檢測 LDLr、SREBP2、SCAP、α-mannosidaseⅡ、SR-A和CD36 mRNA水平；用Western blotting法檢測LDLr、SREBP2和SCAP蛋白表達水平；用免疫

4、細胞化學法檢測α-mannosidaseⅡ蛋白表達水平；用抗人SCAP抗體和抗高爾基體抗體雙重染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察兩種細胞SCAP-SREBP2復合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的定位；用免疫熒光法檢測巨噬細胞SR-A的蛋白表達；應用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測兩種細胞培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子alpha（TNF-α）水平；應用MTT法檢測兩種細胞在不同時間、不同濃度LPS刺激下的存活率。 結(jié)果:1.我們證實LPS通過LDLr增加

5、天然LDL在巨噬細胞內(nèi)積聚。進一步，我們研究了炎癥狀態(tài)下，調(diào)控LDLr表達的兩個重要分子SCAP和SREBP2的表達和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位。實驗證實LPS誘導的炎癥反應增加SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達，進而增大SCAP/Insig1比率，導致Insig1數(shù)量不足，不足以鎖定SCAP-SREBP2復合物，造成SCAP-SREBP2復合物即使在胞內(nèi)高濃度膽固醇水平下，仍從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸到高爾基體。這種異常逃逸打破了LDLr的生理性負反饋調(diào)節(jié)

6、，進而將THP-1巨噬細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?2.我們的實驗證實高爾基體α甘露糖苷酶Ⅱ（α-mannosidaseⅡ）特異性抑制劑苦馬豆堿（swainsonine）能顯著抑制VSMCs細胞SCAP的異常逃逸，減少SCAP-SREBP2復合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位至高爾基體，同時抑制SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達，最終減少LDLr表達和外源性膽固醇的攝入，逆轉(zhuǎn)炎癥誘導的泡沫細胞形成，提示SCAP異常糖基化修飾可能是炎癥導致其在內(nèi)質(zhì)

7、網(wǎng)與高爾基體間異常循環(huán)的機制之一。同時，我們也觀察到苦馬豆堿的抑制效應只在濃度為2.5和5μg/ml時出現(xiàn)，7.5μg/ml的苦馬豆堿反而上調(diào)LDLr表達?？囫R豆堿對α-mannosidaseⅡ特異性抑制，反饋性增加α-mannosidaseⅡ mRNA和蛋白表達。 3.生理情況下，巨噬細胞和VSMCs細胞負荷不同濃度LDL，兩種細胞LDLr表達都顯著減少，但VSMCs細胞LDLr的下調(diào)比巨噬細胞快，而且下調(diào)幅度更大，提示其“下

8、調(diào)敏感”，可以迅速關(guān)閉LDLr，減少脂質(zhì)攝?。划斢蠰PS存在時，兩種細胞LDLr表達均上調(diào)，但巨噬細胞LDLr被LPS上調(diào)的更快，幅度更大，提示其“上調(diào)易感”。同時，我們證實巨噬細胞SR-A水平表達遠遠高于單核細胞和VSMCs細胞。 結(jié)論:我們證實：炎癥可以導致巨噬細胞通過LDLr途徑大量攝入天然LDL，從而導致泡沫細胞形成，氧化LDL不是巨噬細胞泡沫化的唯一膽固醇來源，天然LDL同樣可以致動脈粥樣硬化，這可能是巨噬細胞泡沫樣變

9、的另一條通路；炎癥可以增加高爾基體α-mannosidaseⅡ的活性，加強對SCAP的糖基化修飾，同時增加SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達，促進SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常逃逸到高爾基體，從而增加核轉(zhuǎn)錄因子SREBP2-N進入胞核，啟動LDLr表達，增加膽固醇攝入，導致泡沫細胞形成；在生理情況下，加載LDL時，VSMCs細胞LDLr下調(diào)比巨噬細胞明顯、下調(diào)幅度更大，在炎癥刺激物LPS作用下，巨噬細胞LDLr上調(diào)迅速，而且上調(diào)幅度更大，