HDL和apoA-I模擬肽對(duì)脂肪細(xì)胞分泌功能的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、背景:動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病。肥胖是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而脂肪細(xì)胞的功能改變是引起肥胖的核心因素，因此，研究脂肪細(xì)胞的功能對(duì)于肥胖、冠心病的防治具有重要意義。脂肪細(xì)胞的功能越來越受到重視，并得到重新認(rèn)識(shí)，目前認(rèn)為脂肪細(xì)胞功能改變與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。 脂肪組織是體內(nèi)最大的能量?jī)?chǔ)存器官，脂肪細(xì)胞的主要功能是以甘油三酯的形式儲(chǔ)存過多的能量；此外，脂肪細(xì)胞還具有重要的內(nèi)分泌功能，可以分泌一系列脂肪因子，其中

2、很多與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。脂肪組織可通過分泌各種促炎性的脂肪因子，進(jìn)而引起全身的慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)。脂聯(lián)素是由脂肪組織特異性分泌的一種炎癥相關(guān)性蛋白質(zhì)，目前認(rèn)為脂聯(lián)素是胰島素抵抗、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)性因子。炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNFα)水平升高與動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重性密切相關(guān)，脂肪細(xì)胞是體內(nèi)內(nèi)源性TNFα的重要來源之一。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是單核細(xì)胞強(qiáng)有力的趨化因子，也是動(dòng)脈粥樣硬化反應(yīng)的促發(fā)信號(hào)，脂

3、肪細(xì)胞可在多種刺激物的誘導(dǎo)下產(chǎn)生MCP-1。 脂多糖(LPS)是一種公認(rèn)的炎癥刺激物。低密度脂蛋白(LDL)經(jīng)過氧化修飾后具有致動(dòng)脈粥樣硬化作用，而氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)除了參與形成泡沫細(xì)胞外，還在局部慢性炎癥反應(yīng)中起一定的作用。與oxLDL相反，高密度脂蛋白(HDL)被認(rèn)為具有抗動(dòng)脈粥樣硬化及心血管保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚不十分清楚。研究已經(jīng)證實(shí)，HDL參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝，但HDL對(duì)脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)尚未

4、見報(bào)導(dǎo)。有研究提示，HDL的主要載脂蛋白之一載脂蛋白A-I(apoA-I)和apoA-I模擬肽是有效的抗炎劑并可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有臨床治療潛能，但是apoA-I模擬肽對(duì)脂肪細(xì)胞是否也具有抗炎作用尚不為人所知。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是主要表達(dá)于脂肪組織的一種核受體。核因子kB(NF-kB)調(diào)控多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，參與了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的多個(gè)步驟，在動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBPs

5、)是NF-kB以外的另一類重要的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。目前的研究顯示，PPARγ、NF-kB或C/EBPs均不同程度地參與了某些細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其可能也部分地參與調(diào)控脂肪細(xì)胞脂肪因子的轉(zhuǎn)錄與分泌，但具體作用及信號(hào)通道仍須進(jìn)一步的研究。 目的:觀察HDL和apoA-I模擬肽L-4F對(duì)炎癥狀態(tài)下3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、TNF α及MCP-1的上清液濃度及其mRNA表達(dá)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。 方法: 3

6、T3-L1脂肪細(xì)胞促分化成熟后，分成三組：(1)LPS刺激組：脂多糖(LPS)刺激脂肪細(xì)胞處于炎癥狀態(tài)，給予不同濃度的HDL(10-100μg/ml)和L-4F(1-50μg/ml)干預(yù)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，測(cè)定細(xì)胞上清液脂聯(lián)素濃度，脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)水平，及NF-kB活性。(2)oxLDL刺激1小時(shí)組：oxIDL刺激脂肪細(xì)胞1小時(shí)，給予不同濃度的HDL(10-100μg/ml)和阿托伐他汀(0.1-10μM)，及

7、H-89(10μM)+HDL(100μg/ml)干預(yù)，收集細(xì)胞，測(cè)定脂肪細(xì)胞TNFα和PPARγmRNA表達(dá)水平，IkB蛋白濃度及NF-kB活性。(3)oxLDL刺激不同時(shí)間組：oxLDL分別刺激脂肪細(xì)胞1、6、12小時(shí)，給予不同濃度的HDL(10-100μg/ml)、L-4F(1-50μg/ml)，H-89(10μM)及H-89+FHDL(100μg/ml)或H-89(10μM)+L-4F(50μg/ml)干預(yù)，收集細(xì)胞，測(cè)定脂肪細(xì)胞

8、MCP-1上清液中的濃度和mRNA表達(dá)水平，以及脂肪細(xì)胞核因子C/EBPα、β的蛋白表達(dá)水平；改良Boyden小室法檢測(cè)不同干預(yù)組上清液對(duì)人外周血單核細(xì)胞趨化活性的影響。 結(jié)果: 1.LPS刺激分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞使其脂聯(lián)素分泌和mRNA表達(dá)水平分別下降44％和60％(P<0.05)。 2.HDL和L-4F濃度依賴性上調(diào)炎癥狀態(tài)下3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的分泌及表達(dá)。10、50和100μg/ml HD

9、L分別使脂聯(lián)素水平升高1倍、1.9倍和3.2倍(P<0.05)，1、10,50μg/ml L-4F分別使脂聯(lián)素水平升高1.2倍、2.9倍和3.4倍(P<0.05)。與LPS刺激組(0.36±0.05)比較，10、50、100μg/ml HDL分別使脂聯(lián)素mRNA表達(dá)升高至0.72±0.13、1.05±0.15、1.51±0.11，而1、10、50μg/m L-4F分別使脂聯(lián)素mRNA表達(dá)升高至0.79±0.12、1.40±0.18、1.

10、58±0.10(P均<0.05)。 3.PPARγ在分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞有較高水平的表達(dá)，與LPS刺激組比較，PPARγ表達(dá)在HDL和L-4F干預(yù)后明顯升高(2.85±0.69 vs 0.38±0.19，2.92±0.96 vs 0.38±0.19；P<0.05)，而NF-kB活性在HDL和L-4F干預(yù)后明顯降低(0.48±0.09 vs 1.93±0.59，0.43±0.08 vs 1.93±0.59：P<0.05)

11、。 4.OxLDL(50μg/ml)刺激1小時(shí)使3T3-L1脂肪細(xì)胞TNFα分泌(2.98±1.10 pg/ml vs 8.93±3.26 pg/ml，P<0.001)、mRNA表達(dá)(0.218±0.078 vs 0.633±0.157，P<0.001)及NF-kB活性(1.54±0.44 vs4.08±0.87.P<0.05)明顯增強(qiáng)。 5.阿托伐他汀濃度依賴性降低TNF α分泌及mRNA表達(dá)，抑制NF-kB活化，并增

12、強(qiáng)PPARγmRNA表達(dá)。10μM阿托伐他汀使脂肪細(xì)胞oxLDL誘導(dǎo)的TNFα mRNA表達(dá)降低56.5％，NF-kB活性減少41.2％，而使PPARγmRNA表達(dá)增加至2.83倍。HDL也呈濃度依賴性抑制TNF α分泌及mRNA表達(dá)，NF-kB活化和IkB降解。與oxLDL刺激組比較，100μg/ml HDL使TNFα mRNA表達(dá)降低64.5％，NF-kB活性減少49％，并明顯增加IKB蛋白水平，但對(duì)PPARγmRNA表達(dá)無影響。H

13、DL的這些抗炎效應(yīng)能被蛋白激酶A(PKA)抑制劑H-89部分抑制。 6.OxLDL(50μg/ml)刺激12小時(shí)使脂肪細(xì)胞上清液中MCP-1的濃度和表達(dá)增加至2.13倍，并使得誘導(dǎo)的單核細(xì)胞移動(dòng)距離明顯增力口(69.88±8.19 μm vs 136.75±8.03 μm，P<0.001)。 7.L-4F和HDL均以濃度依賴的方式減少脂肪細(xì)胞MCP-1的表達(dá)分泌，降低單核細(xì)胞趨化活性。50μg/ml L-4F和100Bg

14、/ml HDL分別使MCP-1的表達(dá)分泌降低91±6％和79±7％(P<0.001)。PKA抑制劑H-89(10μM)干預(yù)oxLDL刺激的脂肪細(xì)胞后MCP-1 m RNA的表達(dá)也顯著減少71±7％(P<0.001)，但是，在100μg/ml HDL或50μg/ml L-4F作用的基礎(chǔ)上，H-89(10μM)的孵育并未使得MCP-1mRNA的表達(dá)進(jìn)一步降低(P>0.05)。 8.50μg/ml oxLDL刺激對(duì)脂肪細(xì)胞C/EBP

15、α的表達(dá)無明顯影響，但增加C/EBPβ蛋白量，該作用呈時(shí)間依賴性；H-89、L-4F和HDL干預(yù)均降低脂肪細(xì)胞C/EBPβ的蛋白表達(dá)量。 結(jié)論: 1.LPS和oxLDL均能誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生炎癥狀態(tài)，使其表達(dá)和分泌脂聯(lián)素水平下降，使TNFα及MCP-1的表達(dá)和分泌增強(qiáng)。 2.HDL和L-4F能上調(diào)LPS刺激炎癥狀態(tài)下脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的表達(dá)和分泌，PPARγ和NF-kB可能參與了HDL和L-4F上

16、調(diào)脂聯(lián)素的效應(yīng)過程。 3.阿托伐他汀通過NF-KB和PPARy途徑抑制oxIDL誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞TNFα分泌及mRNA表達(dá)。 4.HDL能抑制oxLDL誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞TNFα分泌和mRNA表達(dá)，其抗炎作用強(qiáng)度與阿托伐他汀相似。PKA-IKB-NF-KB信號(hào)通路是其中作用途徑之一，該效應(yīng)不需要HDL與oxLDL的直接接觸作用。 5.OxLDL時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞C/EBPβ的蛋白表達(dá)。