荷載腫瘤干細(xì)胞抗原的樹突細(xì)胞疫苗聯(lián)合糖脂分子治療小鼠結(jié)腸癌的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述。
　　第一部分 ALDH+腫瘤干細(xì)胞的分選和鑒定
　　目的:本實驗從小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系MC38，及其在小鼠體內(nèi)形成的新鮮腫瘤細(xì)胞中，采用流式細(xì)胞分選技術(shù)，以乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)為標(biāo)志分選出ALDH+細(xì)胞;鑒定分選的ALDH+細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性。
　　方法:以C57BL/6小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系MC38，及其在小鼠體內(nèi)形成的新鮮腫瘤細(xì)胞中，以ALD

2、H為標(biāo)志， ALDEFLUOR試劑染色，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)，分選出ALDH+細(xì)胞。并將分選的細(xì)胞體外無血清培養(yǎng)，觀察腫瘤細(xì)胞球克隆形成能力。體內(nèi)成瘤實驗將不同細(xì)胞數(shù)目梯度的ALDH和ALDH-細(xì)胞接種小鼠，觀察其體內(nèi)成瘤能力。
　　結(jié)果:MC38細(xì)胞系中約6％的細(xì)胞表達為ALDH+，94％不表達ALDH;新鮮腫瘤細(xì)胞中約5％的腫瘤細(xì)胞表達ALDH+，95％不表達ALDH。將分選的細(xì)胞再次染色，細(xì)胞純度達到98％以上。同樣數(shù)目的A

3、LDH+和ALDH-細(xì)胞在相同條件下，無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALDH+細(xì)胞有較大、較多的腫瘤細(xì)胞球克隆形成;而ALDH-細(xì)胞未能或者只形成了極少的細(xì)胞集落。同源小鼠體內(nèi)成瘤實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在觀察終點內(nèi)不同梯度的ALDH+細(xì)胞均能成瘤，而ALDH-細(xì)胞均未能成瘤。
　　結(jié)論:在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系和小鼠結(jié)腸癌皮下腫瘤模型中，以ALDH為標(biāo)記，采用流式分選技術(shù)成功分選出具有腫瘤干細(xì)胞特性，純度高的腫瘤干細(xì)胞群ALDH+細(xì)胞。因此ALD

4、H可以作為小鼠結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞分選的可靠標(biāo)志。這使我們后續(xù)研究體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞抗原對機體免疫功能的影響和誘導(dǎo)的靶向CSCs的抗腫瘤免疫成為可能。
　　第二部分 腫瘤干細(xì)胞疫苗聯(lián)合糖脂類分子對機體免疫功能的影響
　　目的:以腫瘤于細(xì)胞裂解物作為抗原荷載樹突狀細(xì)胞，聯(lián)合能有效激活iNKT細(xì)胞的糖脂類分子α-GC制備新型疫苗。免疫小鼠，驗證其在體內(nèi)對免疫功能的影響。
　　方法:按本實驗室建立的方法常規(guī)分離與培養(yǎng)同源小鼠骨髓來源

5、的樹突細(xì)胞。分選的ALDH+，ALDH-和未分選的腫瘤細(xì)胞反復(fù)凍融裂解，細(xì)胞裂解物作為抗原荷載樹突細(xì)胞。將α-GC或不同抗原加入樹突細(xì)胞培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)過夜，致敏樹突細(xì)胞，次日收集樹突細(xì)胞制備成疫苗。實驗小鼠分組:將8周齡，雌性C57BL/6小鼠，按不同疫苗處理因素隨機分為6組，每組6只:①PBS處理組(PBS);②未分選的腫瘤細(xì)胞裂解物荷載DC疫苗處理組(tumor);③ALDH-細(xì)胞裂解物荷載DC疫苗處理組(ALDH-);④ALDH+

6、細(xì)胞裂解物荷載DC疫苗處理組(ALDH+);⑤α-GC荷載樹突疫苗組(α-GC);⑥ALDH+細(xì)胞裂解物聯(lián)合α-GC荷載DC組(ALDH+α-GC)，該組為實驗組。按上述所述的分組，將疫苗皮下接種在小鼠的側(cè)腹部。按相同的方法，每周接種一次，每次接種1×106個樹突細(xì)胞，連續(xù)三次。于最后1次免疫后24小時收集小鼠脾臟、肝臟和外周血。檢測肝臟中iNKT細(xì)胞數(shù)量，活化成熟指標(biāo):CD69，CD40L和胞內(nèi)分泌IFN-γ量;NK細(xì)胞數(shù)量，及胞內(nèi)分

7、泌IFN-γ量;DC成熟活化指標(biāo):CD80，CD86和DC胞內(nèi)及培養(yǎng)液上清IL-12分泌量，同時檢測外周血Th1細(xì)胞因子(IL2，TNF-α，IFN-γ)和IL-12; Th2型細(xì)胞因子(IL-4，IL-5)等表達量。同樣的方法獨立重復(fù)三次實驗。
　　結(jié)果:1.腫瘤干細(xì)胞疫苗比傳統(tǒng)完整腫瘤細(xì)胞疫苗能更好的刺激機體增加iNKT細(xì)胞的數(shù)量，聯(lián)合α-GC制成的新型疫苗大大增強了這一效果。2.腫瘤干細(xì)胞疫苗雖然比傳統(tǒng)完整腫瘤上調(diào)了iNKT

8、細(xì)胞表面CD69表達但無統(tǒng)計學(xué)意義，而聯(lián)合α-GC后差異明顯，說明腫瘤干細(xì)胞聯(lián)合α-GC這種新型疫苗在體內(nèi)能更好促進iNKT細(xì)胞的活化成熟。3.腫瘤干細(xì)胞疫苗能顯著上調(diào)iNKT細(xì)胞CD40L表達，聯(lián)合α-GC加強了這一作用。4.腫瘤干細(xì)胞疫苗比傳統(tǒng)的完整腫瘤細(xì)胞疫苗能大大促進iNKT細(xì)胞分泌IFN-γ，聯(lián)合α-GC增強了這一功能。5.腫瘤干細(xì)胞疫苗雖然在不同程度上增加了NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力，但無統(tǒng)計學(xué)意義，而腫瘤干細(xì)胞疫苗聯(lián)合α

9、-GC明顯增加了這一功能。6.腫瘤干細(xì)胞疫苗與傳統(tǒng)完整腫瘤細(xì)胞疫苗相比能上調(diào)DCs表面CD80的表達，而這一作用聯(lián)合α-GC得到了加強。7.腫瘤干細(xì)胞疫苗能上調(diào)DCs表面CD86的表達，聯(lián)合α-GC加強了這一作用。8.腫瘤干細(xì)胞疫苗與傳統(tǒng)完整腫瘤細(xì)胞疫苗并沒有增加DCs胞內(nèi)表達IL-12，而聯(lián)合α-GC后明顯增加了DCs胞內(nèi)IL-12的分泌。9.腫瘤干細(xì)胞疫苗與傳統(tǒng)完整腫瘤細(xì)胞疫苗相比增加了DCs上清IL-12的分泌，而聯(lián)合α-GC增強

10、了這一作用。10.實驗組疫苗能增加血清IL-12，IFN-γ，TNFα，IL-2的分泌(P＜0.05)，一定程度上抑制了Th2型細(xì)胞因子IL-4，IL-5的分泌。
　　結(jié)論:成功制備了腫瘤干細(xì)胞聯(lián)合α-GC荷載樹突細(xì)胞的新型疫苗，能促進iNKT細(xì)胞的成熟和活化，上調(diào)了CD69，CD40L的表達，促進iNKT細(xì)胞IFN-γ的分泌;促進NK細(xì)胞IFN-γ的分泌;能促進DCs的成熟與活化，上調(diào)DCs表面CD80，CD86的表達;促進DC

11、s分泌IL-12;促進體內(nèi)Th1型細(xì)胞因子分泌，抑制Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生;朝著向Th1轉(zhuǎn)化，有利于發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　第三部分 腫瘤干細(xì)胞疫苗聯(lián)合糖脂類分子增強抗小鼠結(jié)腸癌免疫
　　目的:腫瘤干細(xì)胞抗原荷載樹突細(xì)胞聯(lián)合α-GC這種新型疫苗免疫小鼠，能促進體內(nèi)iNKT細(xì)胞，NK細(xì)胞和DCs等免疫細(xì)胞的活化成熟。在小鼠結(jié)腸癌模型中，我們進一步驗證這種新型疫苗對小鼠結(jié)腸癌的抗腫瘤作用，并探討其潛在的機制。
　　方法:腫瘤干

12、細(xì)胞抗原的獲得和疫苗的制備方法同第一部分。將8周齡，雌性C57BL/6小鼠，按不同疫苗處理因素隨機分為6組，每組8只:①PBS處理組(PBS);②未分選的腫瘤細(xì)胞裂解物荷載DC疫苗處理組(tumor);③ALDH-細(xì)胞裂解物荷載DC疫苗處理組(ALDH-);④ALDH+細(xì)胞裂解物荷載DC疫苗處理組(ALDH+);⑤α-GC荷載樹突疫苗組（α-GC）;⑥ALDH+細(xì)胞裂解物荷載DC疫苗聯(lián)合α-GC處理組(ALDH++α-GC)，本組為實驗

13、組。按上述所述的分組，將疫苗皮下接種在小鼠的側(cè)腹部。按相同的方法，每周接種一次，每次接種1×106個樹突細(xì)胞，連續(xù)三次。同樣的方法重復(fù)三次獨立實驗。
　　結(jié)果:腫瘤干細(xì)胞疫苗與傳統(tǒng)完整腫瘤細(xì)胞疫苗相比能明顯延長荷瘤小鼠的生存期，聯(lián)合α-GC使這一作用更加明顯。腫瘤干細(xì)胞疫苗與傳統(tǒng)完整腫瘤細(xì)胞疫苗相比在預(yù)防性疫苗的中并沒有明顯抑制腫瘤的生長，而聯(lián)合α-GC能明顯抑制小鼠腫瘤的生長。
　　結(jié)論:腫瘤干細(xì)胞疫苗聯(lián)合糖脂類分子明顯的

14、延長了荷瘤小鼠的生存期，抑制了腫瘤的生長。增加了CD8+T細(xì)胞的比率，減少了MDSC的比率，誘導(dǎo)出了特異性靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
　　全文結(jié)論:
　　1.以ALDH腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志在小鼠結(jié)腸癌模型中，成功分選和鑒定了ALDH+細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性。
　　2.腫瘤干細(xì)胞疫苗聯(lián)合糖脂分子能促進iNKT、NK細(xì)胞活化和誘導(dǎo)DC成熟，并促進Th1型細(xì)胞因子分泌。
　　3.腫瘤干細(xì)胞疫苗聯(lián)合糖脂分子能誘導(dǎo)出特異性靶向殺