誘導高效樹突狀細胞腫瘤疫苗的研究.pdf

1、目的：首先通過優(yōu)化外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PB-MCs)的獲取方法，提高樹突狀細胞(DenDendritic cells DCs)的前體細胞CD14+細胞產(chǎn)出率，并對體外誘導DCS的方法進行改進，獲得高純度的DCs。然后對腫瘤組織進行純化培養(yǎng)，獲得純化的腫瘤細胞并制備成純化的、個體化的凍融抗原。并與腫瘤壞死因子(TNF-α)共同致敏未成熟DCS，制備高純度、個體化DCs疫苗

2、。方法：1.無菌條件下常規(guī)采集外周血，肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。在相同的離心時間，根據(jù)不同的離心力分A、B、C三組，流式細胞儀檢測獲得的PBMCs中CD14+細胞表型，實驗組(A組)與對照組(B、C組)比較有顯著性差異(P<0.05)。2.應用優(yōu)化后的方法獲得PBMCs，計數(shù)后按1×106接種于24孔板，分為A、B兩組。B組為對照組，按文獻方法誘導，A組(實驗組)在貼壁約10小時后，倒置顯微鏡下觀察可

3、見有部分細胞呈懸浮生長，給予再次洗脫。將洗脫的懸浮細胞設為C組。三組均繼續(xù)按文獻方法誘導。第七天進行流式細胞儀檢測DCs表型CD80、CD86、CD83和HLA—DR的表達，確定三組DCs純度和成熟度的差異。3.無菌條件下取乳腺癌組織標本，相同大小兩份(以質(zhì)量計算)，一份制備成為乳腺癌組織凍融抗原。另一份用特殊培養(yǎng)系統(tǒng)對乳腺癌細胞進行短期純化培養(yǎng)，獲得個體化及純化的腫瘤細胞。同時，對乳腺癌細胞株SKBR-3進行培養(yǎng)，將這兩種乳腺癌細胞均

4、制備成細胞凍融抗原。以Lowry法測定蛋白含量，以牛血清白蛋白作為標準。根據(jù)測定結果，蛋白濃度調(diào)至2mg/ml，用微孔濾膜(0.22um)過濾，液氮中保存?zhèn)溆?。應用本研究改良的方法誘導DCS，在第五天加入30ng/mlTNF-a的同時，分別加入個體化乳癌細胞、乳腺癌細胞株及乳腺癌組織凍融抗原100ug/ml，根據(jù)加入抗原不同分為A、B、C三組。第七天獲得成熟的DCs疫苗。流式細胞儀檢測CD80、CD83、CD86、HLA—DR的表達。結

5、果：1.經(jīng)流式細胞儀檢測，優(yōu)化后的分離條件可使CD14+細胞產(chǎn)出率>30％。2.對誘導七天的三組DCs進行流式細胞檢測。結果顯示：A、B兩組與C組比較各檢測表型均有顯著性差異，A、B兩組間比較CD80、CD83、CD86有顯著性差異(P<0.05)。3.A組(純化的腫瘤細胞凍融抗原致敏)、B組(乳癌細胞株凍融抗原致敏)、C組(乳癌組織凍融抗原致敏)三組DCs疫苗均高表達CD80、CD83、CD86、HIA-DR。A、B兩組與C組比較均有

6、顯著性差異(P<0.05)。A、B兩組比較無顯著性差異。結論： 1.本研究優(yōu)化后的對PBMCs提取方法可顯著提高CD14+細胞產(chǎn)出率。2.應用本研究改良后的誘導方法與傳統(tǒng)方法相比，可獲得更高純度和成熟度的DCs。3.個體化、純化的乳腺癌腫瘤抗原負載的DCs疫苗高表達CD80、CD83、CD86、HLA-DR免疫表型。4.本研究結果初步顯示，應用本研究建立的誘導高效、個體化DCs疫苗的方法，可獲得高表達CD80、CD83、CD86、HLA