誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞及糖尿病模型體內(nèi)移植研究.pdf

1、本課題擬在體外模擬胰腺發(fā)育程序，采用表觀遺傳修飾聯(lián)合多種誘導(dǎo)因子的方法誘導(dǎo)ES細(xì)胞逐步向內(nèi)胚層—胰腺前體細(xì)胞—胰島素分泌細(xì)胞分化，旨在進(jìn)一步提高ES源性胰島素分泌細(xì)胞的獲得效率，為體內(nèi)移植研究提供充足、高質(zhì)量的細(xì)胞來源。在體外研究的基礎(chǔ)上，為探索建立一種高效、無創(chuàng)、安全的移植細(xì)胞示蹤方法，我們以超順磁氧化鐵顆粒標(biāo)記ES源性胰島素分泌細(xì)胞，并移植入糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)，通過核磁共振(MRI)活體示蹤技術(shù)動(dòng)態(tài)、連續(xù)、無創(chuàng)性的觀察移植細(xì)胞在糖尿

2、病動(dòng)物模型體內(nèi)定居、遷移、增殖及功能發(fā)揮情況。本課題有望為ES源性胰島素分泌細(xì)胞移植治療糖尿病研究進(jìn)一步奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分表觀遺傳修飾誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞
　　 目的：探討體外模擬胰腺發(fā)育過程，程序性高效誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的可行性，從而為體內(nèi)移植研究提供充足、高質(zhì)量的細(xì)胞來源；同時(shí)從microRNA角度初步探討ES細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的分子機(jī)制。
　　

3、方法：首先通過堿性磷酸酶試驗(yàn)和體內(nèi)分化試驗(yàn)鑒定E14小鼠ES細(xì)胞的分化全能性；然后常規(guī)培養(yǎng)ES細(xì)胞，并懸浮培養(yǎng)4d以形成擬胚體(embryonic bodies，EBs)，轉(zhuǎn)移EBs到鋪有明膠的6孔板中并添加不同濃度的丁酸鈉(1mmol/L，2mmol/L，3mmol/L)開始誘導(dǎo)EBs向胰腺前體細(xì)胞方向分化，分化過程中通過RT-PCR檢測(cè)胰腺前體細(xì)胞特異性標(biāo)志基因巢蛋白(nestin)、胰腺十二指腸同源異形盒(pancreatic/d

4、uodenal homeobox-1，PDX-1)和神經(jīng)元素3(Neurogenin3，NgN3)的mRNA表達(dá)水平，以及肝臟前體細(xì)胞特異性基因細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)，甲胎蛋白(α-fetal protein，AFP)，甲狀腺素運(yùn)載蛋白(transthyretin，TTR)、α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)的mRNA表達(dá)水平，確定丁酸鈉誘導(dǎo)EBs向胰腺前體細(xì)胞方向分化的最佳作用濃度和

5、作用時(shí)間；然后于培養(yǎng)體系中順序添加25ng/mL activin A，10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，10ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocytegrowth factor，HGF)以及10mmol/L尼克酰胺(nicotinamide)，促進(jìn)胰腺前體細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟為胰島素分泌細(xì)胞。采用Real-time PCR和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)成熟的胰島素分泌細(xì)

6、胞特異性標(biāo)志蛋白PDX-1、胰島素(insulin)、C肽(C-peptide)的表達(dá)，通過葡萄糖刺激的胰島素分泌試驗(yàn)檢測(cè)分化細(xì)胞分泌胰島素的功能情況；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)分化細(xì)胞的分化效率；并采用microRNA芯片技術(shù)和real-time PCR檢測(cè)ES細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化過程中microRNA的差異表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：E14 ES細(xì)胞具有分化為內(nèi)、中、外三個(gè)胚層來源組織細(xì)胞的能力；探索丁酸鈉最佳誘導(dǎo)濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

7、1 mmol/L丁酸鈉能明顯促進(jìn)胰腺前體細(xì)胞特異性標(biāo)志基因nestin、PDX-1和NgN3的表達(dá)，隨著丁酸鈉濃度的增加，向胰腺前體細(xì)胞方向的誘導(dǎo)作用逐漸減弱；在1mmol/L丁酸鈉的誘導(dǎo)作用下，與胰腺前體細(xì)胞同屬內(nèi)胚層來源的肝臟前體細(xì)胞特異性標(biāo)志基因CK19、AFP、AAT和TTR開始表達(dá)，隨著丁酸鈉濃度的增加，上述基因表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，以3mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)肝臟前體細(xì)胞基因表達(dá)的作用最強(qiáng)。關(guān)于丁酸鈉最佳作用時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1

8、mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)第3d后可檢測(cè)到胰腺前體細(xì)胞標(biāo)志基因PDX-1、NgN3和p48的表達(dá)，隨后表達(dá)水平逐漸下降；3mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)第3d后，可檢測(cè)到肝臟前體細(xì)胞特異性基因CK19、AFP、AAT和TTR的表達(dá)，且表達(dá)水平隨時(shí)間變化逐漸增強(qiáng)。在應(yīng)用activin A、丁酸鈉誘導(dǎo)EBs向胰腺前體細(xì)胞分化后，序貫以bFGF、尼克酰胺和HGF誘導(dǎo)胰腺前體細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟，RT-PCR檢測(cè)顯示誘導(dǎo)過程中成熟的胰腺特異性標(biāo)志基因insu

9、lin、C-peptide的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，免疫熒光結(jié)果顯示胰腺特異性標(biāo)志蛋白insulin和C-peptide表達(dá)為陽性。葡萄糖刺激的胰島素釋放實(shí)驗(yàn)顯示，在3mmol/L葡萄糖刺激下，30分鐘內(nèi)分化細(xì)胞釋放的胰島素水平是229±32.5pg/mg蛋白，在22mmol/L葡萄糖刺激下，30分鐘內(nèi)分化細(xì)胞釋放的胰島素水平是1373±116pg/mg蛋白，高糖刺激下胰島素的釋放水平約為低糖刺激時(shí)胰島素水平的6倍。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，分化

10、終末期C-peptide陽性的細(xì)胞數(shù)約占分化細(xì)胞總數(shù)的21％。microRNA芯片及Real-time PCR檢測(cè)顯示ES細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞過程中，一種胰腺特異性microRNA-miR-375的水平呈階段性差異表達(dá)。
　　 結(jié)論：低濃度的組蛋白去乙?；敢种箘┒∷徕c短時(shí)間作用可以較高效率的誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞分化為胰腺前體細(xì)胞，與其它胰腺分化相關(guān)誘導(dǎo)因子聯(lián)合作用，能進(jìn)一步提高成熟胰島素分泌細(xì)胞的獲得效率；胰腺特異性micro

11、RNAmiR-375可能在ES細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化過程中起著重要的調(diào)控作用。
　　 第二部分ES源性胰島素分泌細(xì)胞糖尿病模型體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討以核磁共振(MRI)活體示蹤技術(shù)動(dòng)態(tài)、連續(xù)、無創(chuàng)性的觀察ES源性胰島素分泌細(xì)胞在糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)定居、遷移、增殖及功能發(fā)揮情況的可行性。
　　 方法：分別以10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL濃度的超順磁性氧化鐵顆粒(菲立磁

12、-硫酸魚精蛋白復(fù)合體)標(biāo)記待移植ES源性胰島素分泌細(xì)胞，通過流式細(xì)胞技術(shù)及透射電鏡觀察菲立磁對(duì)細(xì)胞增殖的影響，以普魯士藍(lán)染色試驗(yàn)計(jì)算菲立磁標(biāo)記效率，并體外檢測(cè)數(shù)量級(jí)為1×104、5×104、1×105、5×105、1×106的標(biāo)記細(xì)胞在MRI下引發(fā)磁信號(hào)改變情況。以STZ腹腔注射制備小鼠糖尿病模型，監(jiān)測(cè)血糖水平的變化。成模后將菲立磁標(biāo)記的ES源性胰島素分泌細(xì)胞移植到糖尿病模型的左腎包膜下，定期行MRI掃描觀察移植細(xì)胞在受體體內(nèi)的定居、增

13、殖和遷移情況；根據(jù)MRI結(jié)果切取出現(xiàn)低信號(hào)改變區(qū)域的組織，行普魯士藍(lán)染色觀察移植細(xì)胞在組織局部的分布情況，并通過免疫熒光檢測(cè)insulin的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證；同時(shí)檢測(cè)糖尿病動(dòng)物模型的血糖水平及存活率，評(píng)估移植細(xì)胞在體內(nèi)功能發(fā)揮情況。
　　 結(jié)果：10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL濃度的菲立磁標(biāo)記對(duì)ES源性胰島素分泌細(xì)胞形態(tài)無明顯影響，凋亡率和細(xì)胞增殖活性與未標(biāo)記細(xì)胞相比無顯著差別。菲立磁-硫酸魚精蛋白復(fù)

14、合體孵育ES細(xì)胞4h后，經(jīng)普魯士藍(lán)染色可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)染顆粒，10μg/mL、25μg/mL菲立磁標(biāo)記組標(biāo)記率較50μg/mL、100μg/mL標(biāo)記組為低(p＜0.05)，50μg/mL和100μg/mL標(biāo)記組的標(biāo)記效率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，在50μg/mL時(shí)標(biāo)記效率已達(dá)98％以上。體外MRI檢測(cè)結(jié)果顯示，50μg/mL菲立磁標(biāo)記的5×104個(gè)ES源性胰島素分泌細(xì)胞即可引起T1WI和T2WI序列低信號(hào)改變，尤其以T2WI序

15、列改變更為明顯。標(biāo)記細(xì)胞移植到小鼠糖尿病模型左腎包膜下之后定期(1w,2w,3w,4w)行腹部MRI掃描，由于移植細(xì)胞內(nèi)的氧化鐵顆?？梢鹉I臟異常低信號(hào)改變，移植后即可檢測(cè)到移植細(xì)胞定居于左腎包膜下，隨著時(shí)間推移可以觀察到部分移植細(xì)胞由左腎包膜下逐漸向腹膜后、右腎遷移，移植第3周MRI檢測(cè)到脾臟內(nèi)彌漫性低信號(hào)改變，提示部分移植細(xì)胞遷移至脾臟。普魯士藍(lán)染色可見腎包膜及脾實(shí)質(zhì)內(nèi)均出現(xiàn)藍(lán)染的顆粒，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示在腎包膜下及脾實(shí)質(zhì)內(nèi)可見i

16、nsulin陽性的胰島素分泌細(xì)胞存在。糖尿病動(dòng)物模型造模成功后，血糖水平均超過13.9 mmol/L。與對(duì)照組相比，移植ES源性胰島素分泌細(xì)胞組的血糖水平在移植1w后逐漸下降，至移植約第2周時(shí)，血糖水平降至10.86±2.09 mmol/L。在實(shí)驗(yàn)第4周，移植分化細(xì)胞組動(dòng)物模型的存活率約為62.5％，對(duì)照組存活率為37.5％。
　　 結(jié)論：超順磁性氧化鐵顆粒菲立磁可高效、安全地對(duì)ES源性胰島素分泌細(xì)胞進(jìn)行磁性標(biāo)記；MRI活體示蹤