一種與微系統(tǒng)兼容的大腸桿菌活細胞檢測方法研究.pdf

1、通常來講，大量的病原微生物活躍在包括空氣、水源、土壤以及食物等人們?nèi)粘Ｉ瞽h(huán)境中。為了更好的維護公眾健康，快速而準確的環(huán)境評估就顯得十分必要，尤其是針對致病菌等微生物的活性檢測，因為大多數(shù)情況下只有活的菌體才會對人類產(chǎn)生威脅。然而在實際操作中，檢測速度與輕便性卻是在開發(fā)及時有效的細菌活性檢測方法過程中不得不面對的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的病原微生物活性檢測依賴于以細菌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的分析手段，但這樣的方法通常都比較耗費時間，同時還必須依賴于實驗室特有的設(shè)

2、備，難以達到便攜化現(xiàn)場監(jiān)測的要求。而近些年隨著微器件加工技術(shù)的飛速發(fā)展，已經(jīng)有越來越多的生物分析過程可以成功地在微型分析系統(tǒng)(芯片實驗室labonachip或微全分析系統(tǒng)micrototalanalysissystem，μTAS)上演示。以微型化的形式進行生物檢測有著很多優(yōu)越性，例如較小的樣本體積與較少的試劑消耗。除此之外，其在一微小器件上集成多種操作模塊的能力以及隨之而來帶給開發(fā)真正意義上便攜式分析設(shè)備的希望，使得很多研究者都投身到這

3、一領(lǐng)域中來。然而目前為止，對于如何在微型分析系統(tǒng)上實現(xiàn)進行微生物活性檢測的方法研究還很有限。 本文著重研究一種具有微系統(tǒng)兼容性的對活性大腸桿菌進行快速檢測的方法，以期應(yīng)用于食物與水體等的質(zhì)量監(jiān)控。在這一方法中，大腸桿菌熱激蛋白(heatshockprotein，hsp)GroEL的mRNA被用作細胞活性的標(biāo)志物，通過檢測這種物質(zhì)的存在已否來判斷細胞活性。整個策略從對大腸桿菌細胞進行可控的高溫?zé)峒ら_始(47℃，20分鐘)，在這一過

4、程中標(biāo)志物GroELmRNA被轉(zhuǎn)錄。之后，引入能與指示物mRNA特異性配對的5'端生物素標(biāo)記的捕獲探針與目標(biāo)mRNA分子雜交，再加入親和素修飾的磁性顆粒與捕獲探針進行共價結(jié)合，這樣細胞活性的標(biāo)志物GroELmRNA就可以通過外加磁場與其他細胞雜質(zhì)分離。 最后，在經(jīng)過RT-PCR(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction)對標(biāo)志物的放大后，最終信號的定量分析采用傳統(tǒng)的凝膠電泳或基于A

5、g/Au電化學(xué)反應(yīng)的方法來檢測。 在研究GroELmRNA對細胞活性的表征特性中發(fā)現(xiàn)，熱激溫度與持續(xù)時間等條件對標(biāo)志物mRNA的轉(zhuǎn)錄水平有著很大影響；同時還發(fā)現(xiàn)熱激過程后一旦環(huán)境溫度回到室溫狀態(tài)下，目標(biāo)mRNA會在幾分鐘內(nèi)自行降解。在mRNA磁性分離的過程中，對分離的特異性、可重復(fù)性以及DNA污染等問題也分別進行了研究。最后，實驗驗證了基于Ag/Au電化學(xué)反應(yīng)的分析方法具有比常規(guī)凝膠電泳更為靈敏的檢測范圍并可區(qū)別出菌體濃度達到1