雙黃補(bǔ)在牙周組織工程中對(duì)牙周組織再生修復(fù)的作用.pdf

1、目的:
　　 牙周炎是侵犯牙齦和牙周組織的慢性炎癥，是一種細(xì)菌感染的破壞性疾病，其主要特征為牙周袋的形成及袋壁的炎癥，牙槽骨吸收和牙齒逐漸松動(dòng)。目前牙周病的治療方法很多，在臨床上雖取得了一定成效，但均未取得理想的效果。如何使牙周病治療獲得牙周新附著，實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生修復(fù)，一直是人們努力的方向，近年來，牙周組織工程的出現(xiàn)及其技術(shù)的不斷完備，為牙周組織工程在牙周病的治療及牙周組織缺損再生修復(fù)方面提供了嶄新的研究空間。
　　

2、 牙周組織工程包括三大要素即具有增殖分化潛能的種子細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的生長因子以及利于細(xì)胞粘附生長的細(xì)胞外基質(zhì)（支架）材料。牙周膜細(xì)胞(periodontalligamentcells，PDLCs)是牙周組織工程中理想的種子細(xì)胞，在適宜的刺激下，可分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)牙周病變組織的再生修復(fù)，但PDLCs來源有限，須拔除一定量自體牙后才能獲得，且其培養(yǎng)成功率相對(duì)較低而不能被廣泛應(yīng)用。目前研究發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細(xì)胞

3、在一定刺激下也具有一定的成骨表型，且因取材方便、創(chuàng)傷小、繁殖能力強(qiáng)、培養(yǎng)成功率高而成為牙周組織工程種子細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。中草藥因?qū)θ梭w刺激小、毒副作用小等特點(diǎn)得到人們的關(guān)注，中藥雙黃補(bǔ)由黃連、黃芩、骨碎補(bǔ)按一定比例熬制而成，其中黃連提取物及黃芩提取物對(duì)牙周炎致病菌有明顯抑制作用，并且適當(dāng)濃度的骨碎補(bǔ)也可增強(qiáng)牙齦成纖維細(xì)胞的繁殖能力及誘導(dǎo)其成骨表型。
　　 本實(shí)驗(yàn)以雙黃補(bǔ)作為牙周組織工程中的生長因子，通過構(gòu)建牙齦成纖維細(xì)胞（Ging

4、ivalfibroblasts，GF）-玉米醇溶蛋白支架(ZeinScaffold)-雙黃補(bǔ)復(fù)合體并應(yīng)用于比格犬牙周缺損模型中，探討雙黃補(bǔ)在牙周組織工程中對(duì)牙周組織再生修復(fù)的作用，為雙黃補(bǔ)在臨床治療牙周病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.牙齦成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及來源鑒定
　　 將切取的Beagle犬頰側(cè)牙齦組織，轉(zhuǎn)移至無菌環(huán)境，DMEM沖洗3次，然后移入含少量DMEM的培養(yǎng)皿中，將其剪成1mm×1mm

5、×1mm大小的組織塊，采用改良組織塊法培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞。
　　 取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，免疫組化ABC法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白染色鑒定其來源，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，光鏡下觀察。
　　 2.玉米醇溶蛋白支架制備
　　 將玉米醇溶蛋白溶于酒精溶液后，加入氯化鈉致孔劑，采用溶劑澆鑄/粒子瀝濾法制備支架，將支架切成5mm×4mm×1mm大小，紫外線消毒2小時(shí)備用。
　　 3.雙黃補(bǔ)培養(yǎng)液的制備
　

6、　 將黃連、黃芩、骨碎補(bǔ)按一定比例混合，蒸餾水浸泡30min，分別加8倍體積及6倍體積的水煎煮兩次，水提醇沉法配制成1g/ml生藥的雙黃補(bǔ)煎液，活性炭脫色，調(diào)節(jié)PH值為7.0～7.1，濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 4.牙齦成纖維細(xì)胞-支架復(fù)合體及牙齦成纖維細(xì)胞-支架-雙黃補(bǔ)復(fù)合體制備
　　 37℃下，將玉米醇溶蛋白支架分別置于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液及含100μg/ml質(zhì)量濃度的中藥雙黃補(bǔ)培養(yǎng)液的96孔板中

7、浸提24小時(shí)，取第4代生長良好的細(xì)胞，以1.5×105的細(xì)胞濃度接種于支架上，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在支架粘附情況，以備用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
　　 5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 選用健康雄性清潔級(jí)Beagle犬2只，體重約15Kg，月齡6-12月，以每犬上頜54(⊥)45，下頜8743(⊥)3478作為手術(shù)部位，每組5個(gè)牙位，在每牙位頰側(cè)制備牙周缺損，分別將Zein支架、GF-Zein復(fù)合體及GF-Zein-雙黃補(bǔ)復(fù)合體植入相應(yīng)牙位，空白對(duì)

8、照組不做任何處理，間斷縫合牙齦組織。術(shù)后3個(gè)月，取8(⊥)8標(biāo)本行掃描電鏡觀察，其余標(biāo)本行組織學(xué)觀察及測量（組織學(xué)測量指標(biāo):骨缺損高度、新生牙槽骨高度、新生牙骨質(zhì)高度、結(jié)合上皮長度）以及免疫組織化學(xué)染色定量分析胰島素樣生長因子(insulinlikegrowthfactor-1，IGF-1)及骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的表達(dá)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均以(X)±S表示，采用SPSS13.0統(tǒng)

9、計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析比較各組缺損區(qū)牙槽骨生成的差異以及比較各組IGF-1和OPN陽性細(xì)胞率的差異，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.牙齦成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及來源鑒定
　　 牙齦成纖維細(xì)胞大約在培養(yǎng)的第7天由組織塊游出，圍繞組織快周圍呈放射狀排列，細(xì)胞呈長梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，可見多個(gè)胞漿突，核圓形或卵圓形。
　　 經(jīng)免疫組織化學(xué)ABC法染色后，顯示抗波形蛋白染色陽性、抗角蛋

10、白染色陰性，證實(shí)為中胚層來源，符合成纖維細(xì)胞的特性，可用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.牙齦成纖維細(xì)胞-支架復(fù)合體及牙齦成纖維細(xì)胞-支架-雙黃補(bǔ)復(fù)合體掃描電鏡觀察
　　 掃描電鏡下可見，雙黃補(bǔ)作用下粘附在玉米醇溶蛋白支架上的牙齦成纖維細(xì)胞數(shù)目較多，呈長梭形或星形，伸出偽足并橫跨孔隙交織成網(wǎng)狀。無雙黃補(bǔ)誘導(dǎo)作用下粘附在玉米醇溶蛋白支架上的細(xì)胞數(shù)目較少，多呈星形，且主要黏附生長在孔隙陷窩內(nèi)。
　　 3.牙體牙周聯(lián)合標(biāo)本觀察

11、>　　 3.1組織學(xué)觀察
　　 術(shù)后3個(gè)月，GF-Zein-雙黃補(bǔ)復(fù)合體組與其余三組相比，牙周組織中炎癥細(xì)胞明顯減少，可見再生的牙槽骨及牙骨質(zhì)。
　　 3.2組織學(xué)測量
　　 術(shù)后3個(gè)月，GF-Zein-雙黃補(bǔ)復(fù)合體組新生牙槽骨生長高度(1.16±0.06)mm較其余三組明顯增高(P＜0.05)。而新生牙骨質(zhì)高度與結(jié)合上皮長度各組之間無顯著差別(P＞0.05)。
　　 3.3掃描電鏡觀察
　　

12、術(shù)后3個(gè)月，GF-Zein-雙黃補(bǔ)復(fù)合體組的再生牙槽骨較其余三組可見排列規(guī)則的骨小梁，趨于成熟的哈弗氏系統(tǒng)。
　　 3.4免疫組化行IGF-1及OPN定量分析
　　 術(shù)后3個(gè)月，GF-Zein-雙黃補(bǔ)復(fù)合體組新生牙槽骨周IGF-1的陽性細(xì)胞率(24.32±1.85)％高于其余組的陽性細(xì)胞率，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。GF-Zein-雙黃補(bǔ)復(fù)合體組新生牙槽骨周圍OPN的陽性細(xì)胞率(12.68±1.25)％與空白對(duì)照組相

13、比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而GF-Zein-雙黃補(bǔ)復(fù)合體組與GF-Zein復(fù)合體組及Zein組新生牙槽骨周圍OPN的陽性細(xì)胞率相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但是GF-Zein-雙黃補(bǔ)復(fù)合體組新生牙槽骨周圍可見陽性表達(dá)的成骨細(xì)胞數(shù)目明顯較多。
　　 結(jié)論:
　　 1.雙黃補(bǔ)在牙周組織工程中可有效控制牙周組織中炎癥反應(yīng)，為牙周組織修復(fù)提供良好環(huán)境。
　　 2.雙黃補(bǔ)牙周組織工程中可刺激牙齦成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)