三七單體皂苷對細(xì)胞縫隙連接的影響與其增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性作用的關(guān)系研究.pdf

1、目的：觀察三七單體皂苷（Rg1、Rb1、R1、Re）對穩(wěn)定表達(dá)連接蛋白32和連接蛋白26（connexin32/connexin26, Cx32/26）的Hela細(xì)胞縫隙連接(gap junction, GJ)功能的作用及其對順鉑細(xì)胞毒性的影響；同時進(jìn)一步探討三七單體皂苷能否通過改變GJ功能增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性作用。
　　方法：1.轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx32/26的Hela細(xì)胞的培養(yǎng)、篩選及誘導(dǎo)：本實驗選用使用雙向質(zhì)粒（能夠表達(dá)異質(zhì)性

2、Cx32/26(PBI-Cx32T/Cx26)的載體質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。這種雙向質(zhì)?？梢栽谝粋€啟動子的控制下同時表達(dá)Cx32和Cx26。一般情況下，Cx不表達(dá)；需要表達(dá)時，先用含 G-418、潮霉素的培養(yǎng)基篩選細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基中加入多西環(huán)素（Doxycycline，Dx）誘導(dǎo) Cx表達(dá)。這樣能夠避免因過度表達(dá)Cx引起的細(xì)胞傷害。2.“細(xì)胞接種熒光示蹤法”觀察三七單體皂苷對培養(yǎng)細(xì)胞GJ功能的影響：將表達(dá)有Cx32/26的HeLa細(xì)

3、胞與熒光劑Calcine-AM共同孵育，制成“供體細(xì)胞（“Donor cell”）,在“Donor cell”中加入不同濃度的藥物。顯微鏡下挑選生長融合的細(xì)胞作為接受細(xì)胞，將上述含有不同藥物的“Donor cell”接種到接受細(xì)胞上，培養(yǎng)4小時,待形成穩(wěn)定的GJ后,熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)一個“供體細(xì)胞”周圍含有Calcine的“接受細(xì)胞”數(shù)作為評價GJ功能的指標(biāo)。3.“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”觀察三七皂苷對順鉑細(xì)胞毒性的影響：用不同密度

4、接種細(xì)胞的方法分別獲得有GJ形成（已融合）的細(xì)胞和無GJ形成（未融合）的細(xì)胞。在上述細(xì)胞，觀察三七皂苷單體預(yù)處理4h后，順鉑作用1h，對培養(yǎng)細(xì)胞的集落數(shù)的影響是否是通過GJ產(chǎn)生的。以細(xì)胞集落形成率的降低作為順鉑的細(xì)胞毒性指標(biāo)。4.蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blot）檢測三七單體皂苷對細(xì)胞中Cx32/26的表達(dá)水平的影響：收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；BCA法蛋白定量，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性；15％聚丙烯酰氨凝膠電泳；電轉(zhuǎn)

5、移至PVDF膜上；Western封閉液封閉2h；一抗孵育過夜；洗膜后二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG（1:5000）孵育1h；洗膜后于BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)曝光，Quantity One分析軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：1.“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”結(jié)果顯示在有GJ形成的細(xì)胞，GJ抑制劑2-APB（2.3μg/ml）可顯著升高順鉑組的細(xì)胞集落形成率（P<0.05）；GJ增強(qiáng)劑RA（3μg/ml）可顯著降低順鉑組的細(xì)胞集落形

6、成率（P<0.05）。結(jié)果表明增強(qiáng)GJ功能可增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性，降低GJ功能可減弱順鉑的細(xì)胞毒性。2.“細(xì)胞接種熒光示蹤法”結(jié)果顯示，與陰性對照組相比較，Rb1(5μM-100μM)和 Re(5μM-100μM)作用4h對細(xì)胞GJ功能均無明顯影響（P>0.05）；5μM、10μM Rg1對GJ功能的影響與陰性對照組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），25μM、50μM、100μM Rg1作用細(xì)胞4h后，供體細(xì)胞周圍含有Calcine-

7、AM的接受細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且呈一定的劑量依賴性，其中100μM Rg1對GJ功能的增強(qiáng)作用最為明顯，其增強(qiáng)率為44.04%±8.71%；100μM Rg1作用不同時間（4h、24h、48h）對GJ功能的影響無明顯差異（P>0.05）；R1（10μM-100μM）能濃度依賴性的增強(qiáng)由Cx32/26組成的HeLa細(xì)胞的GJ功能，50μM R1繼續(xù)作用24h、48h對GJ功能的影響與4h相比較無明顯差異。3.Western blot結(jié)果顯示

8、，與陰性對照組比較，不同濃度的Rg1（25μM-100μM）和R1（25μM-100μM）作用4h對HeLa細(xì)胞Cx32/26的表達(dá)水平均無顯著性差異（P>0.05）。4.在有GJ形成的細(xì)胞，100μM Rg1預(yù)處理細(xì)胞4h后，加入順鉑作用1h，Rg1與順鉑聯(lián)合使用組的細(xì)胞集落形成率(0.29±0.12)顯著低于單用順鉑組(0.48±0.07)，表明在有GJ形成時Rg1能增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性，而在無GJ形成的細(xì)胞，Rg1對順鉑的細(xì)胞集落形

9、成率無明顯影響；在有GJ形成的細(xì)胞和無 GJ形成的細(xì)胞，R1（50μM）與順鉑合用組的細(xì)胞集落形成率與順鉑組相比較均無明顯差異（P>0.05），結(jié)果表明R1對順鉑的細(xì)胞毒性無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1.有GJ形成時，下調(diào)細(xì)胞GJ功能能顯著降低順鉑的細(xì)胞毒性；上調(diào)細(xì)胞GJ功能能顯著增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性。
　　2.Rb1、Re對Cx32/26組成的GJ功能無明顯影響，Rg1、R1能顯著增強(qiáng)Cx32/26組成的GJ功能。<