人參皂苷Rg1通過前額皮層星形膠質(zhì)細胞縫隙連接發(fā)揮抗抑郁作用的研究.pdf

1、在當(dāng)今社會，情感疾病如抑郁癥、雙向情感障礙等已是最廣為存在的精神疾病。人群中約有16％的人在他們的人生當(dāng)中受到一次或多次抑郁癥的困擾。重度抑郁癥(Major depressive disorder, MDD)是以持續(xù)的心情低落、自卑、有負(fù)罪感、焦慮、認(rèn)知能力下降及其他行為癥狀等為主要特征的精神疾病，病情嚴(yán)重者有自殺傾向。毫無疑問， MDD是人類極度痛苦的表現(xiàn)，已成為自殺死亡的首要原因。約15%的抑郁病人死于繼發(fā)疾病，MDD患者至少占全部

2、自殺人數(shù)的90%。MDD被認(rèn)為是引起其他疾病的危險因素，也是導(dǎo)致非致死性疾病的主要原因之一，給世界帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。迄今，抑郁癥的發(fā)病機制仍不清楚，但是可以肯定生物、心理及社會等諸多因素都與抑郁癥的發(fā)病有關(guān)。據(jù)估計遺傳因素占抑郁癥發(fā)病因素的40-50%，其他非遺傳因素如應(yīng)激、病毒感染、情感傷害、神經(jīng)發(fā)育異常使得抑郁癥的發(fā)病機制更加復(fù)雜。情緒，認(rèn)知障礙等MDD癥狀等是整個大腦網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)相互作用的結(jié)果，而不是個別蛋白質(zhì)、受體、或神經(jīng)元等的

3、突發(fā)病變。根據(jù)大量的實驗研究結(jié)果，人們就抑郁癥的分子機制提出了很多假說，如單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說、下丘腦-垂體-腎上腺軸失調(diào)假說(the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA軸)、神經(jīng)營養(yǎng)因子假說、受體假說等，但是具體機制至今仍未不明確。
　　目前的抗抑郁癥的藥物主要集中在5-羥色胺(5-HT)、多巴胺和去甲腎上腺素三個單胺神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，如三環(huán)類抗抑郁藥，選擇性5-HT再攝取抑制劑(sele

4、ctive serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)，單胺氧化酶抑制劑(MAOIs)等。這些藥物治療往往集中在某一種抑郁癥行為表現(xiàn)上，如食欲、睡眠、神經(jīng)運動的改變。藥物作用在關(guān)鍵的系統(tǒng)如5-HT系統(tǒng)一定時間內(nèi)可能效果很明顯，但是大腦受多個神經(jīng)環(huán)路的調(diào)控，藥物能夠同時作用于多個系統(tǒng)可能對MDD或慢性疾病的恢復(fù)更加有效。目前臨床一線抗抑郁藥物，如SSRIs類藥物氟西汀，雖然與三環(huán)類抗抑郁藥相比療效有了很大的

5、提高，但是眾多病人的耐受及療效延遲嚴(yán)重影響了抑郁癥的治療。因此，探索抑郁癥的發(fā)病機制以及開發(fā)起效更快療效更好的新藥已成為亟待解決的問題。
　　目前已有大量的研究結(jié)果表明前額皮層(prefrontal cortex, PFC)與抑郁癥密切相關(guān)。PFC區(qū)神經(jīng)元與海馬腦區(qū)、杏仁核、伏隔核等皮層下組織存在豐富的神經(jīng)環(huán)路，PFC與這些腦區(qū)之間的傳入或(和)傳出神經(jīng)元投遞障礙與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。神經(jīng)膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元具有支持、保護、營養(yǎng)、修

6、復(fù)等作用。越來越多的研究結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細胞功能失調(diào)與抑郁癥相關(guān)。星形膠質(zhì)細胞功能的發(fā)揮主要取決于細胞間通訊。星形膠質(zhì)細胞通過縫隙連通道(gap junction channels, GJs)實現(xiàn)相鄰細胞間的物質(zhì)交流。前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PFC區(qū)星形膠質(zhì)細胞縫隙連接功能障礙與MDD密切相關(guān)。
　　人參(Panax ginseng C. A. Mey)是多年生五加科草本植物的根，廣泛分布于我國東北、朝鮮半島、俄羅斯等地，在東亞國家人

7、參已有兩千多年的用藥歷史，對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、癌癥以及糖尿病均有療效。至今，人參已經(jīng)廣泛應(yīng)用于世界各地，是最廣為應(yīng)用的中藥之一，有“萬能藥”之美譽。人參的活性成分主要包括多糖類、皂苷類，多肽、脂肪酸等。人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1, Rg1)是人參皂苷類的一種，是人參的主要活性成分之一，具有多種藥理學(xué)活性。越來越多的研究結(jié)果表明 Rg1有多種神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用，能增加神經(jīng)祖細胞的分化能力促進神經(jīng)發(fā)

8、生。Rg1通過抑制細胞周期依賴性蛋白激-4(cyclin dependent kinase4, CD4)等作用減輕大鼠大腦皮層β1-40淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病的研究中，Rg1亦能通過激活胰島素樣生長因-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)發(fā)揮神經(jīng)保護作用。此外，Rg1能明顯緩解腦缺血再灌注損傷。近期的研究發(fā)現(xiàn)Rg1能通過促進神經(jīng)發(fā)生、提高突觸可

9、塑性、調(diào)節(jié) HPA軸等作用發(fā)揮抗抑郁作用。Rg1能否通過PFC區(qū)星形膠質(zhì)細胞GJ發(fā)揮抗抑郁作用至今仍未見報道。
　　慢性不可預(yù)知性應(yīng)激法(chronic unpredictable stress, CUS)模型始發(fā)于上個世紀(jì)八十年代末期，用于臨床及臨床前抑郁癥的病因?qū)W研究。動物長期暴露于一系列溫和、不可預(yù)知的應(yīng)激，動物會出現(xiàn)獎賞系統(tǒng)受損的表現(xiàn)，類似于抑郁癥患者快感缺失的癥狀，如蔗糖飲水量下降，慢性傳統(tǒng)抗抑郁藥給藥治療，能逆轉(zhuǎn)上述表

10、現(xiàn)，證明了該模型的有效性。目前，這種模型已被用于多種抑郁癥相關(guān)神經(jīng)生物學(xué)的研究。
　　基于以上研究背景，本課題欲通過 CUS法誘導(dǎo)大鼠抑郁模型，探討Rg1與PFC區(qū)星形膠質(zhì)細胞GJ功能之間的關(guān)系。具體研究內(nèi)容如下：
　　第一部分 CUS法誘導(dǎo)大鼠抑郁模型的建立
　　目的：觀察Rg1對模型動物抑郁樣行為學(xué)改變的影響
　　方法：除對照組動物正常飼養(yǎng)外，應(yīng)激動物以夾尾、噪音、禁食、傾籠45°過夜、冰水游泳、束縛、禁水、

11、擁擠過夜、熱水游泳、濕籠、孤養(yǎng)、24 h照明、關(guān)燈24 h等方法造模，每天隨機抽取兩種應(yīng)激方式應(yīng)激，連續(xù)應(yīng)激35 d，并分別以Rg15，10，20 mg/kg三個劑量灌胃給藥4 w，以文拉法辛為陽性對照。應(yīng)激結(jié)束后，通過開場實驗(Open field test, OFT)、糖水偏好實驗(Sucrose preference test, SPT)、新奇攝食抑制實驗(novelty suppressed feeding test, NSFT

12、)和強迫游泳實驗(forced swimming test, FST)等方法分別對動物跨越格子數(shù)、站立次數(shù)、糖水偏好度、12 min內(nèi)新奇攝食抑郁潛伏期及6 min內(nèi)強迫游泳靜止不動時間等行為學(xué)指標(biāo)進行檢測，并對Rg1的抗抑郁作用進行比較和評估。
　　結(jié)果：CUS開始前，OPT實驗結(jié)果表明各組動物的跨越格子數(shù)(P=0.9108)及站立次數(shù)(P=0.9603)均無顯著性差異。SPT基線檢測結(jié)果顯示各組動物的糖水偏好多度均在85%以上

13、，各組之間沒有顯著性差異(P=0.9986)。CUS應(yīng)激5 w后，應(yīng)激組動物糖水偏好度下降15%以上，Rg15，10，20 mg/kg長期給藥皆能使動物糖水偏好度達85%以上，與模型組檢測結(jié)果想比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。NSFT實驗檢測結(jié)果顯示，正常對照組攝食潛伏期平均為220.7 s，而模型組平均時間達到461.5 s，兩組數(shù)據(jù)相比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，Rg15，10，20 mg/kg及文拉法辛雖能縮短動

14、物攝食潛伏期，但均未檢測出顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。在 FST實驗中，與正常對照組相比較，模型組動物游泳靜止不動時間延長1倍左右，與模型組相比較，Rg15，10，20 mg/kg長期給藥明顯縮短了動物的靜止不動時間(P＜0.01)。
　　結(jié)論：CUS應(yīng)激5 w后能引起動物出現(xiàn)明顯的抑郁樣行為學(xué)改變，抑郁模型造模成功。Rg15，10，20 mg/kg長期給藥顯著提高動物糖水偏好度和縮短動物強迫游泳靜止不動時間，顯示出良好的抗抑

15、郁效果，其中以Rg120 mg/kg劑量組給藥效果最佳。
　　第二部分 Rg1對 CUS大鼠前額皮層星形膠質(zhì)細胞縫隙連接功能及其相關(guān)蛋白的影響
　　目的：研究Rg1與CUS大鼠前額皮層膠質(zhì)細胞縫隙功能的關(guān)系
　　方法：在 CUS應(yīng)激動物前額皮層腦定位注射小分子熒光黃染料(Luciferyellow，LY)，通過熒光顯微鏡觀察動物術(shù)后腦組織冰凍切片，檢測LY的擴散距離以及星形膠質(zhì)細胞偶聯(lián)數(shù)，觀察Rg15，10，20 mg

16、/kg長期給藥對LY擴散距離及細胞偶聯(lián)數(shù)的影響；將CUS動物斷頭取腦，通多透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy, TEM)觀察 CUS動物前額皮層星形膠質(zhì)細胞縫隙連接的超微結(jié)構(gòu)變化，以及Rg120 mg/kg長期給藥對星形膠質(zhì)細胞縫隙連接超微結(jié)構(gòu)的影響；留取 CUS動物新鮮腦組織，并分離出前額皮質(zhì)區(qū)，采用蛋白免疫印跡法(Western blotting, WB)檢測 CUS動物前額皮層區(qū)縫隙連

17、接蛋白Cx43的蛋白水平，觀察Rg15，10，20 mg/kg長期給藥對縫隙連接蛋白表達水平的影響，并對Cx43的表達水平與SPT及FST中動物行為學(xué)改變進行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：與正常對照組相比較，CUS模型組動物的LY擴散距離縮小了約60%，Rg110，20 mg/kg長期給藥能顯著增大LY擴散距離，與模型組相比，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。細胞偶聯(lián)數(shù)檢測結(jié)果與上述結(jié)果一致；電鏡實驗結(jié)果顯示，CUS可引起相鄰星形膠

18、質(zhì)細胞間超微結(jié)構(gòu)受損，縫隙連接寬度增大，與正常對照組相比寬度增加2倍多，有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)，Rg120 mg/kg長期給藥能明顯改善縫隙連接的超微病變(P＜0.001)；WB實驗結(jié)果表明，CUS能顯著降低縫隙連接蛋白Cx43的蛋白水平(P＜0.01)，Rg120 mg/kg長期給藥能有效提高Cx43的蛋白表達(P＜0.05)，且Cx43的蛋白水平與SPT及FST行為學(xué)表現(xiàn)顯著相關(guān)。
　　結(jié)論：Rg1可通過調(diào)節(jié)前額

19、皮層星形膠質(zhì)細胞縫隙連接蛋白Cx43的表達發(fā)揮抗抑郁作用。
　　第三部分前額皮層腦定位注射縫隙連接阻斷劑生胃酮(Carbenoxolone，CBX)，觀察Rg1給藥對動物行為學(xué)及縫隙連接蛋白Cx43的影響
　　目的：進一步驗證Rg1對縫隙連接的關(guān)系
　　方法：前額皮層腦定位注射CBX(100 mmol/L)或等量PBS作為對照，分別給予Rg120 mg/kg或溶劑水灌胃，每天兩次。連續(xù)三天給藥后開始進行SPT、NSFT

20、及FST等行為學(xué)檢測，檢測方法同前。行為學(xué)實驗結(jié)束后，斷頭取腦，留取新鮮前額皮質(zhì)腦組織，進行WB檢測，方法同前。
　　結(jié)果：SPT結(jié)果顯示，CBX定位注射后，動物糖水偏好度明顯降低(P＜0.001)，與溶劑組相比較，Rg1給藥能明顯提高動物糖水偏好度(P＜0.001)；在NSFT實驗中，CBX組動物平均攝食潛伏為285.3 s，Rg1能明顯縮短動物攝食潛伏期(P＜0.001)；FST檢測結(jié)果顯示， CBX使動物游泳靜止不動時間延長