重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)Smac-DIABLO促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)MBT-2膀胱癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、【目的】 膀胱腫瘤為泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，在我國(guó)其發(fā)病率在泌尿系腫瘤中居首位，且大多數(shù)膀胱癌表現(xiàn)為多中心性與復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。目前臨床的治療手段主要是手術(shù)治療和術(shù)后化療，但復(fù)發(fā)率較高，而目前常用的化療藥物在使用一段時(shí)間后都出現(xiàn)不同程度耐藥性，且并發(fā)癥較多。抗腫瘤化療的策略主要在于清除腫瘤細(xì)胞，盡管其作用機(jī)制各異，但化學(xué)藥物所致胞毒作用的終末效應(yīng)均為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而腫瘤細(xì)胞對(duì)于藥物所致的抵抗性是腫瘤治療失敗的主要原因。通過(guò)調(diào)控凋亡信

2、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的胞內(nèi)調(diào)控因子，將有可能影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。因此，本研究以膀胱腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，以重組腺相關(guān)病毒為載體，介導(dǎo)第二個(gè)線粒體來(lái)源的胱氨酸酶激活劑(Smac/DIABLO)參與凋亡調(diào)控，研究膀胱癌細(xì)胞對(duì)普通化療藥物的抵抗性降低的過(guò)程，并從分子水平嘗試探討腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗性降低的分子機(jī)制。 【方法】 應(yīng)用細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)獲得鼠膀胱腫瘤細(xì)胞(MBT-2)后，將轉(zhuǎn)染有第二個(gè)線粒體來(lái)源的胱氨酸酶激

3、活劑的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-Smac/DIABLO)加入到培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)染 MBT-2 細(xì)胞，RT-PCR 法測(cè)定 Smac/DIABLO在細(xì)胞中的表達(dá)情況，當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)穩(wěn)定后加入普通化療藥物絲裂霉素誘導(dǎo)凋亡啟動(dòng)，運(yùn)用四甲基偶氮唑藍(lán)還原反應(yīng)(MTT法)測(cè)定MBT-2細(xì)胞增殖的抑制作用，對(duì)照比較轉(zhuǎn)染Smac/DIABLO前后化療藥物胞誘膀胱癌細(xì)導(dǎo)凋亡的差異。流式細(xì)胞儀測(cè)定不同加藥組對(duì)MBT-2膀胱癌細(xì)胞的凋亡的誘導(dǎo)情況，所得數(shù)據(jù)使用SAS9

4、.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。 【結(jié)果】 1.rAAV-Smae/DIABLO轉(zhuǎn)染MBT-2腫瘤細(xì)胞后RT-PCR檢測(cè)Smac/DIABLO表達(dá)情況 rAAV-Smac/DIABLO 轉(zhuǎn)染 MBT-2 腫瘤細(xì)胞后，采用 RT-PCR 法檢測(cè)Smac/DIABLO 在細(xì)胞中的表達(dá)量，24小時(shí)后有條帶出現(xiàn)，48小時(shí)后穩(wěn)定表達(dá)。 2.rAAV-Smac轉(zhuǎn)染MBT-2后提高了化療藥物的抑制率 2.1 絲裂霉素對(duì)MBT

5、-2腫瘤細(xì)胞的抑制情況 MTT檢測(cè)顯示按照濃度梯度加入絲裂霉素，觀察對(duì)MBT-2腫瘤細(xì)胞均有不同程度抑制增殖作用，同空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01). 2.2 rAAV-Smac/DIABLO轉(zhuǎn)染MBT-2后化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制情況 MTT檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染 rAAV-Smac/DIABLO后48小時(shí)聯(lián)合使用絲裂霉素對(duì)MBT-2 腫瘤細(xì)胞均有不同程度抑制增殖作用，同空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01

6、)。 2.3 對(duì)2.1和2.2數(shù)據(jù)進(jìn)行2×5析因設(shè)計(jì)的方差分析 對(duì)2.1和2.2數(shù)據(jù)建立2×5的析因設(shè)計(jì)方差分析統(tǒng)計(jì)模型，計(jì)算各統(tǒng)計(jì)量結(jié)果顯示 rAAV-Smac/DIABLO 轉(zhuǎn)染因素使腫瘤細(xì)胞的抑制率有差別，轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞抑制率更高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P<0.05) 3.rAAV-Smac轉(zhuǎn)染MBT-2后降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性(本實(shí)驗(yàn)組所用MMC均為0.05mg/ml低劑量誘導(dǎo)凋亡啟動(dòng)) 3.

7、1 化療藥物采用低劑量時(shí)，rAAV-Smac/DIABLO+MMC組腫瘤細(xì)胞的抑制率最高 采用低濃度絲裂霉素誘導(dǎo)凋亡啟動(dòng)，經(jīng)MTT檢測(cè)顯示各加藥組(空白組、MMC 組、Smac/DIABLO 組、Smac/DIABLO+MMC 組)中Smac組抑制率7.94±1.85；MMC組抑制率9.23±2.23；rAAV-Smac/DIABLO+MMC組抑制率28.38±3.84：rAAV-Smac/DIABLO+MMC 組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑

8、制率高于其它組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P<0.01) 3.2 化療藥物采用低劑量時(shí)，rAAV-Smac/DIABLO+MMC 組腫瘤細(xì)胞的凋亡率最高 采用低濃度絲裂霉素誘導(dǎo)凋亡啟動(dòng)，經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)顯示各加藥組(空白組、MMC組、Smac/DIABLO 組、Smac/DIABLO+MMC 組)中Smac 組凋亡率7.29±1.25；MMC組抑制率5.25±1.21；rAAV-Smac/DIABLO+MMC 組抑制率22.18

9、±1.62；rAAV-Smac/DIABLO+MMC 組腫瘤細(xì)胞的凋亡率高于其它組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P<0.01)其中rAAV-Smac/DIABLO 聯(lián)合使用絲裂霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用最高，二者具有協(xié)同效應(yīng)，凋亡峰明顯。(P<0.01) 【結(jié)論】 1.rAAV-Smac/DIABLO 能夠有效的轉(zhuǎn)染 MBT-2 膀胱癌細(xì)胞，大約在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)表達(dá)量達(dá)到治療水平，表達(dá)持續(xù)穩(wěn)定。 2.轉(zhuǎn)染了Smac/DI