血管緊張素2型受體誘導膀胱癌細胞(EJ)凋亡的實驗研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤的。它在中國有很高的發(fā)病率。傳統(tǒng)的治療方法包括手術、放療和化療，化療的價值有一定的局限性，這是因為化療會傷害正常細胞并導致復發(fā)率增高。近年來，隨著分子生物學取得了突飛猛進的進展，基因治療現如今已成為一種治療膀胱癌的新的策略。
　　 血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)中的一種生物活性肽，它通過與某些特定器

2、官的AT1受體(AT1R)和AT2受體(AT2R)結合，調控心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和組織的生長。AT2R在胚胎組織中高度表達，而在人體出生后其表達急劇降低。當心血管系統(tǒng)或者神經系統(tǒng)發(fā)生損傷時，AT2R會在修復組織損傷的過程中重新表達。有研究發(fā)現AT2R具有抑制細胞周期的功能，它可能在癌癥中能夠發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。提高AT2R在多種癌細胞系，例如前列腺癌、肺癌、嗜鉻細胞瘤和結直腸癌等細胞系中的水平，能夠誘導細胞凋亡，而且癌細胞的生長會受到抑

3、制。
　　 在我們的實驗研究中，用表達AT2R的重組腺病毒載體將AT2R導入膀胱癌細胞中，以此來提高AT2R的表達水平，通過Q-PCR，流式細胞分選，凋亡染色等實驗技術，檢驗AT2R的過度表達對膀胱癌細胞周期和凋亡的作用，并進一步探討其可能的細胞內作用機制。
　　 方法與材料
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 1.1 復蘇
　　 把凍存管從液氮中取出來，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動。液體都融化后，拿出

4、來噴灑酒精后放到超凈工作臺里。把上述細胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中1000轉離心5分鐘。把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細胞懸浮起來。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動，使培養(yǎng)皿中的細胞均勻分布。
　　 1.2 傳代
　　 培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋率達到80％-90％時要傳代。把原有培養(yǎng)基吸掉，加適當的胰蛋白酶，消化1-2分鐘，細胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化，用移液槍吹打

5、細胞，把細胞都懸浮起來。把細胞吸到15ml的離心管中，1000轉離心5分鐘。倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細胞都吹起來。移入培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 2.重組腺病毒制備我們采用以下兩種重組腺病毒載體，一種是腺病毒載體包含被巨細胞病毒啟動子控制的增強綠色熒光蛋白基因(Ad-CMV-EGFP)，而另一種腺病毒載體包含AT2R基因和被巨細胞病毒啟動子控制的增強綠色熒光蛋白基因(Ad-G-AT2R-EGFP)。
　　 293T

6、細胞接種于150mm2的組織培養(yǎng)皿中。感染復數(multiplicity of infection，MOI，virus/cell)為10的重組腺病毒載體被轉到入293T細胞中。36至48小時后可觀察細胞病變。通過凍融和兩個氯化銫密度梯度的超速離心進行提純，根據腺病毒DNA的OD260nm和OD280nm計算病毒顆粒和純度，并通過空斑實驗檢測病毒滴度。
　　 3.測量提取RNA的濃度用含AT2R的腺病毒感染EJ細胞，48小時后，收

7、集細胞，依據TRIZOL試劑盒說明書，提取RNA。之后，利用紫外分光光度計測定RNA的濃度及RNA在260nm和280nm的OD值。
　　 4.檢測AT2R的表達我們從兩個方面去觀察，(1)，腺病毒感染膀胱癌(EJ)細胞后，分別在24h、48h、72h通過熒光顯微鏡觀察膀胱癌細胞，是否有綠色熒光蛋白的高效表達。(2)，運用QPCR的技術，在腺病毒（含有Ad-G-AT2R-EGFP），對照組腺病毒(Ad-CMV-EGFP)，感染膀

8、胱癌細胞48小時后。按照TRIZOL使用說明書，提取膀胱癌細胞RNA，進行逆轉錄，轉錄成CDNA，AT2R引物為5'-CCACCCTTGCCACTACTAGCA-3';5'-CATTGTTGCCAGAGAT GTTCACA-3'.然后使用熒光定量PCR技術，其目的是為了檢測細胞內AT2的表達水平。
　　 5.AT2R基因對EJ細胞形態(tài)的影響膀胱癌細胞（EJ細胞系，106/ml每孔）被接種于150mm2的組織培養(yǎng)皿中。第二天，Ad

9、-CMV-EGFP或Ad-G-AT2R-EGFP被轉導入膀胱癌細胞中。細胞培養(yǎng)液為添加10％FBS的DMEM。24小時、48小時和72小時后觀察細胞形態(tài)。培養(yǎng)48小時后的細胞被用于凋亡試驗。
　　 6.AT2R基因對EJ細胞周期的影響。
　　 膀胱癌細胞經過腺病毒感染后48小時，胰酶消化，懸浮細胞，經過PBS洗滌和離心后，用冰凍的70％乙醇固定至少18小時。然后放置于保持室溫的暗室中，細胞在300μL的0.1％PI(50

10、mg/L propridium iodide，0.1％ sodium-citrate，0.1％tritonX-100)中再次懸浮30分鐘。運用流式細胞術和ModFit LT software(Verity)進行細胞周期分析。
　　 7.AT2R基因對EJ凋亡的影響為檢測凋亡的細胞，在病毒轉導細胞48小時后，我們依據試劑盒的說明書進行TUNEL凋亡染色試驗。細胞核中如果具有棕色顆粒的細胞為TUNEL陽性細胞。如果細胞核中未有棕色顆

11、粒的細胞為TUNEL陰性細胞，即未發(fā)生凋亡細胞。
　　 8.蛋白印跡試驗收集細胞樣本進行蛋白印跡試驗(Western blot)。使用RIPA裂解液裂解細胞并且離心以獲得含有蛋白質的上清液。測量蛋白質濃度，然后依據蛋白印跡試驗說明書知道，經行蛋白印跡試驗，其中一抗包括抗p38 MAPK抗體、抗磷酸化P38(PP38)、抗P53抗體、抗磷酸化P53(pp53)抗體和抗激活的caspase3抗體。這些抗體從Cell Signalin

12、g Technology購得?？功录拥鞍卓贵w和二抗從Sigma-Aldrich購得。
　　 9.siRNA干擾P38、P53我們運用RNA干擾技術，干擾膀胱癌細胞(EJ細胞)P38、P53的合成，取對數期生長良好的膀胱癌細胞(EJ)，傳代培養(yǎng)后24小時，運用脂質體轉染技術，將P38、P53干擾RNA轉導入細胞內，沉默P38、P53基因，24小時后，加入腺病毒Ad-CMV-EGFP、Ad-G-AT2-EGFP.觀察沉默P38、P

13、53是否會對AT2R過表達導致膀胱癌細胞凋亡是否會產生影響，以明確AT2R過表達導致膀胱癌細胞凋亡是否是通過P38、P53路徑導致。
　　 10.數據分析數據是用三個獨立實驗數據的mean±SE表示。通過單因素或雙因素方差分析并根據邦弗朗尼(Bonferroni)事后檢驗法來比較每個平均值，從而來分析數據的顯著性。由于P＜0.05，說明數據具有顯著差異。
　　 結果：
　　 1.重組腺病毒載體構建和轉導兩種重組腺

14、病毒載體(Ad-CMV-EGFP，Ad-G-AT2R-EGFP)通過兩個氯化銫密度梯度超速離心進行提純，檢測其OD260，計算其密度分別為1×109和1.2×109，并且純度良好(OD260/OD280＞1.3)。熒光顯微鏡圖顯示EJ細胞轉入了Ad-G-AT2R-EGFP(10 ifu/cell)，Ad-CMV-EGFP(10 ifu/cell)48小時后，熒光活性均高，而轉入了Ad-G-AT2R-EGFP(100 ifu/cell)則

15、顯示出明顯抑制細胞的生長，這樣可能存在病毒對EJ細胞產生細胞毒性，對照組Ad-CMV-EGFP(10ifu/cell)細胞生長狀態(tài)良好，并無細胞數量減少或者凋亡的現象發(fā)生，這表明，10MOI值的腺病毒對膀胱細胞癌(EJ)的生長并無太大影響。通過實驗表明，10ifu/cell為腺病毒感染EJ細胞最適合濃度。EJ細胞對腺病毒具有高度敏感性，并且隨著病毒量的不斷加大，其轉染率也不斷提高。當病毒量為10 MOI時，轉染率達就可達到90％以上。但

16、當病毒量繼續(xù)升高達到100 MOI時，細胞生長會受到一定程度的病毒抑制。據此我們確定10 MOI為以下實驗的最佳感染劑量（既可達到較高感染率，又不會對細胞生長造成明顯影響）。
　　 2.測量提取RNA的濃度細胞培養(yǎng)48h后，通過TRizol提取RNA，利用紫外分光光度計測定RNA的濃度及RNA在260nm和280nm的OD值。測得Ad-CMV-EGFP為0.75ug/ulOD260/OD280=1.95,Ad-G-AT2-EGF

17、P為0.8 ug/ul OD260/OD280=1.92。說明所提取的RNA純度較好，為進一步的QPCR檢測實驗奠定基礎。
　　 3.AT2在腺病毒轉導膀胱癌細胞后的表達熒光定量PCR結果顯示:在轉導腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP的實驗組膀胱癌細胞內的AT2的含量明顯高于轉導腺病毒Ad-CMV-EGFP的對照組膀胱癌細胞。這表示，我們的載體是構建成功，并且成功制備了含有AT2基因的腺病毒。
　　 4.在EJ細胞中AT

18、2R高表達對細胞生長和細胞周期的作用通過細胞周期分析顯示，與轉導Ad-CMV-EGFP(10 ifu/cell，24 hours)的EJ細胞即對照組細胞相比，轉導了Ad-G-AT2R-EGFP(10 ifu/cell，24 hours)的膀胱癌細胞中，處于G1期的細胞明顯增加，處于S期的細胞增加不明顯。處于G2期的細胞數量明顯減少。
　　 5.膀胱癌細胞中AT2R過度表達能誘導細胞凋亡膀胱癌細胞轉導入Ad-G-AT2R-EGFP

19、兩天后，與轉導Ad-CMV-EGFP的對照組細胞相比，出現了大量凋亡的細胞。運用TUNEL法可以檢測到轉導Ad-G-AT2R-EGFP的細胞中存在凋亡的細胞，即那些細胞核中含有棕色顆粒的細胞。
　　 可以在轉導Ad-G-AT2R-EGFP的細胞中觀察到細胞毒性，這些細胞中有大量細胞死亡（n=3次試驗），而轉導Ad-CMV-EGFP的細胞中出現極少數死亡細胞（n=3次試驗）。
　　 6.AT2R誘導細胞凋亡是否通過p38

20、MAPK和Caspase-3信號通路？蛋白印跡試驗的結果顯示膀胱癌細胞43kDa的蛋白質與抗磷酸化p38 MAPK(pp38)反應。與轉導Ad-CMV-EGFP的細胞相比，轉導Ad-G-AT2R-EGFP的細胞的p38 MAPK，pp38 MAPK水平并無明顯變化。與對照組細胞相比較，轉導Ad-G-AT2R-EGFP的細胞的pp53等活性均輕微增高。轉導AD-G-AT2-EGFP的細胞的P53與轉導Ad-CMV-EGFP相比較而言變化不

21、大，沒有顯著差異。與對照組相比較，轉導Ad-G-AT2-EGFP的膀胱癌細胞中，caspase-3條帶明顯多于對照組Ad-CMV-EGFP的條帶。
　　 7.siRNA干擾P38、P53干擾膀胱癌細胞(EJ細胞)P38、P53的合成后，我們發(fā)現，對AT2R過表達產生膀胱癌細胞凋亡，并無明顯改變，細胞生長依舊受到抑制，細胞凋亡依舊存在。經過雙盲法在計算機下計算凋亡細胞數目發(fā)現，與未被沉默掉P38、P53的癌細胞相比，凋亡細胞數目基

22、本相似。
　　 結論與討論:
　　 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的一種。與傳統(tǒng)治療方法相比，基因治療現在已經成為一種新的方法。腎素-血管緊張素系統(tǒng)在調控癌細胞生長和細胞周期方面發(fā)揮著重要的作用。血管緊張素Ⅱ的2型受體(AngⅡ type2 receptors，AT2R)在前列腺癌、肺癌、嗜鉻細胞瘤和結直腸癌細胞等癌細胞中具有抑制生長和抑制細胞周期的功能。為了進一步研究AT2R在膀胱癌細胞中所起的作用，我們在實驗室構建了表達A

23、T2R的重組腺病毒載體，這些載體通過腺病毒被導入膀胱癌細胞株（EJ細胞株），這樣可以導致AT2R在細胞中的過度表達。通進一步分析表明在轉導后的膀胱癌細胞株中，AT2R水平是有所提高的，在細胞周期的分析中，誘導細胞周期的停滯，尤其是S期的細胞明顯減少，而G1的細胞有所增多;另外，AT2R的過度表達還誘導了EJ細胞的凋亡。根據蛋白印跡試驗和反轉錄PCR試驗的結果發(fā)現AT2R誘導細胞凋亡的功能與p38絲裂原激活蛋白激酶，caspase-3和p

24、53的激活并無相關。AT2R誘導膀胱腫瘤細胞凋亡可能的機制，還需要更進一步研究。本實驗存在以下優(yōu)點，第一，首次報道了AT2R過表達導致膀胱癌細胞凋亡。這為膀胱癌的基因治療，提供了一種新的思路。第二，本實驗在病毒量10MOI值時，就對膀胱癌細胞產生明顯的凋亡作用，這對未來研究AT2R過表達導致膀胱癌細胞凋亡提供了毒性小，感染能力高，病毒含量低等優(yōu)良的載體。第三，我們實驗成功的把AT2R與膀胱癌相結合。并發(fā)現其凋亡通路并非通過傳統(tǒng)的P38，