豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADC30毒株HNyc15的感染性克隆構(gòu)建與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的一種嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的傳染性疾病。2012年開始，從我國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)分離到一類與2008年在美國(guó)分離到的美洲型NADC30毒株有很高的核苷酸相似度的PRRSV毒株，最近

2、幾年這類毒株在我國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)廣泛發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)命名為PRRSV類NADC30毒株。該類毒株具有中等致病力，有研究表明現(xiàn)有的商品化疫苗已經(jīng)不能提供完全的保護(hù)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此，分析該類毒株的遺傳演化及分子致病機(jī)理具有重要的意義。本論文在對(duì)PRRSV類NADC30毒株HNyc15分離鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了分離毒株的全基因組序列測(cè)定和進(jìn)化分析，以期探究該類毒株的變異規(guī)律;利用反向遺傳操作技術(shù)，構(gòu)建了類NADC30毒株HNyc15的

3、感染性克隆，以期為開展該類毒株致病機(jī)理、變異機(jī)制等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究對(duì)河南伊川豬場(chǎng)的血清樣品進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示為PRRSV陽性，且分型檢測(cè)初步表明其為類NADC30毒株;利用豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophages，PAM)進(jìn)行病毒分離，接種PAM細(xì)胞后48h可觀察到典型的細(xì)胞病變，96h收獲細(xì)胞培養(yǎng)物;對(duì)其做RT-PCR，擴(kuò)增Nsp2基因片段進(jìn)行序列測(cè)定，Nsp2基因測(cè)序

4、結(jié)果比對(duì)顯示，與NADC30毒株Nsp2區(qū)域有著相同的131個(gè)氨基酸缺失。因此，確定為類NADC30毒株，命名為HNyc15株。
　　本研究根據(jù)Genbank上公布的NADC30毒株的全基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)HNyc15毒株的全基因序列分為12段擴(kuò)增，將各段基因序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行拼接，基于國(guó)內(nèi)外已有毒株的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析、遺傳進(jìn)化分析、重組分析。全基因序列測(cè)定表明，HNyc15毒株基因組全長(zhǎng)為15049bp;與已報(bào)道的毒株全基

5、因序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，HNyc15株與LV株、VR-2332株、NADC30株的核苷酸一致性分別為60.4％、85.2％、93.8％;進(jìn)化分析表明，HNyc15、HENAN-XINX、HNjz15、HENAN-HEB、NADC30屬于同一亞群，該亞群大多是由2012年之后在筆者分離到的類NADC30毒株所組成;軟件分析重組情況表明，HNyc15株在ORF2-4區(qū)域重組了VR-2332和CH-1a的基因片段。由此推斷，我國(guó)的類NADC30毒株可

6、能是由美國(guó)NADC30株與美洲型毒株經(jīng)歷基因重組和逐漸積累變異而來的。
　　本研究將PRRSV類NADC30毒株HNyc15基因組根據(jù)合適的酶切位點(diǎn)分為A、B、C、D、E、F六個(gè)片段，設(shè)計(jì)引物分段擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物插入中間載體pEASY-Blunt simple構(gòu)建中間質(zhì)粒;在pBluescriptⅡSK(+)載體多克隆位點(diǎn)(MCS)的上游插入CMV真核啟動(dòng)子，下游引入用于提高轉(zhuǎn)染效率的丁型肝炎病毒的核酶因子(HDV)及BGH終

7、止信號(hào)序列，改造出轉(zhuǎn)錄載體pBlue-CMV-HB;利用各片段兩端的單一酶切位點(diǎn)將六個(gè)片段連入改造后的轉(zhuǎn)錄載體pBlue-CMV-HB中構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pBlue-CMV-HNyc15，并在B、C片段連接處通過同義突變引入酶切位點(diǎn)XbaⅠ，作為感染性克隆的遺傳標(biāo)記。轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，48h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清接種PAM細(xì)胞，接種后48h可在顯微鏡下觀察到明顯的細(xì)胞病變。通過IPMA鑒定表明病毒拯救成功，酶切鑒定遺傳標(biāo)記存在于拯