豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADC30毒株HNyc15的感染性克隆構建與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的一種嚴重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的傳染性疾病。2012年開始，從我國養(yǎng)豬場分離到一類與2008年在美國分離到的美洲型NADC30毒株有很高的核苷酸相似度的PRRSV毒株，最近

2、幾年這類毒株在我國養(yǎng)豬場廣泛發(fā)現(xiàn)，在我國命名為PRRSV類NADC30毒株。該類毒株具有中等致病力，有研究表明現(xiàn)有的商品化疫苗已經不能提供完全的保護，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經濟損失。因此，分析該類毒株的遺傳演化及分子致病機理具有重要的意義。本論文在對PRRSV類NADC30毒株HNyc15分離鑒定的基礎上，進行了分離毒株的全基因組序列測定和進化分析，以期探究該類毒株的變異規(guī)律;利用反向遺傳操作技術，構建了類NADC30毒株HNyc15的

3、感染性克隆，以期為開展該類毒株致病機理、變異機制等相關研究奠定基礎。
　　本研究對河南伊川豬場的血清樣品進行PRRSV檢測，檢測結果顯示為PRRSV陽性，且分型檢測初步表明其為類NADC30毒株;利用豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophages，PAM)進行病毒分離，接種PAM細胞后48h可觀察到典型的細胞病變，96h收獲細胞培養(yǎng)物;對其做RT-PCR，擴增Nsp2基因片段進行序列測定，Nsp2基因測序

4、結果比對顯示，與NADC30毒株Nsp2區(qū)域有著相同的131個氨基酸缺失。因此，確定為類NADC30毒株，命名為HNyc15株。
　　本研究根據(jù)Genbank上公布的NADC30毒株的全基因序列設計引物，對HNyc15毒株的全基因序列分為12段擴增，將各段基因序列測定結果進行拼接，基于國內外已有毒株的全基因組序列進行比對分析、遺傳進化分析、重組分析。全基因序列測定表明，HNyc15毒株基因組全長為15049bp;與已報道的毒株全基

5、因序列對比發(fā)現(xiàn)，HNyc15株與LV株、VR-2332株、NADC30株的核苷酸一致性分別為60.4％、85.2％、93.8％;進化分析表明，HNyc15、HENAN-XINX、HNjz15、HENAN-HEB、NADC30屬于同一亞群，該亞群大多是由2012年之后在筆者分離到的類NADC30毒株所組成;軟件分析重組情況表明，HNyc15株在ORF2-4區(qū)域重組了VR-2332和CH-1a的基因片段。由此推斷，我國的類NADC30毒株可

6、能是由美國NADC30株與美洲型毒株經歷基因重組和逐漸積累變異而來的。
　　本研究將PRRSV類NADC30毒株HNyc15基因組根據(jù)合適的酶切位點分為A、B、C、D、E、F六個片段，設計引物分段擴增，將擴增后的產物插入中間載體pEASY-Blunt simple構建中間質粒;在pBluescriptⅡSK(+)載體多克隆位點(MCS)的上游插入CMV真核啟動子，下游引入用于提高轉染效率的丁型肝炎病毒的核酶因子(HDV)及BGH終

7、止信號序列，改造出轉錄載體pBlue-CMV-HB;利用各片段兩端的單一酶切位點將六個片段連入改造后的轉錄載體pBlue-CMV-HB中構建全長cDNA克隆質粒pBlue-CMV-HNyc15，并在B、C片段連接處通過同義突變引入酶切位點XbaⅠ，作為感染性克隆的遺傳標記。轉染BHK-21細胞，48h后收獲細胞培養(yǎng)上清接種PAM細胞，接種后48h可在顯微鏡下觀察到明顯的細胞病變。通過IPMA鑒定表明病毒拯救成功，酶切鑒定遺傳標記存在于拯