豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是一種能引起母豬繁殖障礙、新生仔豬呼吸道癥狀及高死亡率的傳染病。該病于1987年首先暴發(fā)于美國，隨后迅速向世界各地蔓延；我國郭寶清等于1996年從疑似本病的豬群中分離到PRRSV，從而確認(rèn)了PRRS在我國的存在。由于基因的變異，近兩年我國大部分地區(qū)暴發(fā)了以高傳染性、高死亡率為特征的高致病性藍(lán)耳病，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 目前PRRS的確診依賴于病毒的分離鑒定、血清學(xué)診斷方法以及分子生物學(xué)診斷方法等

2、。血清學(xué)診斷方法包括免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、間接熒光抗體試驗(IFA)、乳膠凝集試驗(LAT)、血清中和試驗(SN)以及酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等；分子生物學(xué)診斷方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、核酸探針原位雜交技術(shù)(ISH)等。這些診斷方法由于檢測時間較長及檢測所需儀器設(shè)備較昂貴，多數(shù)不適合于臨床快速診斷。近幾年來興起的免疫膠體金診斷試紙法很好的彌補(bǔ)了這些不足，但要想成功的開發(fā)出膠體金診斷試紙，首先必須制備高親和

3、力、高特異性的單克隆抗體。本實驗的目的就是制備高親和力、高特異性的抗PRRSV N蛋白的單克隆抗體，為下一步開發(fā)PRRS膠體金診斷試紙建立基礎(chǔ)。 本試驗利用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)已構(gòu)建的含有PRRSV N蛋白基因的重組表達(dá)載體陽性菌，在37℃條件下，用終濃度1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h。經(jīng)SDS—PAGE分析，表明N基因在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)。經(jīng)鎳柱親和層析純化，獲得了純度較高、免疫學(xué)活性較好的N蛋白。以此蛋白作為抗原對BalB/C小

4、鼠進(jìn)行長程免疫，取抗體效價較高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞用PEG-1500進(jìn)行融合，融合率為60.6％。建立間接ELISA方法，用于檢測雜交瘤細(xì)胞上清中的單克隆抗體，初檢陽性率為16.1％。經(jīng)多次亞克隆及反復(fù)篩選，獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗PRRSV單抗的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4D3和5F6。將得到的單抗株進(jìn)行初步鑒定，兩單抗株特異性針對PRRSV共同的抗原表位。4D3和5F6雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過反復(fù)凍存、復(fù)蘇及多次傳代，均能分泌較高效價