豬繁殖與呼吸綜合征病毒GSWW-15株感染性克隆的構(gòu)建與NSP2缺失標(biāo)記研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種重要傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙和仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。目前，PRRS在全球范圍內(nèi)流行，2006年，我國(guó)南方地區(qū)爆發(fā)高致病性PRRS(HP-PRRS)，給養(yǎng)豬帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV變異范圍廣，病毒感染后造成免疫功能的損害，保護(hù)性免疫應(yīng)答水平低，病毒持續(xù)感染

2、時(shí)間長(zhǎng)，其分子機(jī)理仍然不清楚。PRRSV感染性克隆是研究病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能的重要工具，建立國(guó)內(nèi)流行毒株的反向遺傳學(xué)技術(shù)平臺(tái)將為研究病毒的感染機(jī)理和免疫機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　根據(jù)已測(cè)定的PRRSV/GSWW/15分離株的全長(zhǎng)基因組序列信息，采用合成生物學(xué)的方法，將全長(zhǎng)基因組序列分為兩段（7636bp和7774bp）分別插入低拷貝pBR322載體中，然后將兩個(gè)半長(zhǎng)片段相連接得到全長(zhǎng)cDNA克隆。將質(zhì)粒線化后，體外轉(zhuǎn)錄獲得全長(zhǎng)RNA，經(jīng)

3、電穿孔轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞拯救獲得了初代病毒。初代病毒接種Marc-145細(xì)胞進(jìn)行傳代，接毒后36 h即可觀察到完全的致病變效應(yīng)(CPE)。通過(guò)RT-PCR、間接免疫熒光、測(cè)序驗(yàn)證，證明成功獲得了PRRSV/GSWW/15株的感染性克隆。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)拯救病毒復(fù)制能力與原田間分離毒沒(méi)有顯著差異，拯救病毒感染后48 h達(dá)復(fù)制的最高水平，最高滴度達(dá)1×1010 copies/mL。本研究表明，采用長(zhǎng)片段基因合成的方法進(jìn)行PRRSV感

4、染性克隆的構(gòu)建，方法可行且速度快，為PRRSV流行毒感染致病機(jī)理、免疫機(jī)制和基于反向遺傳學(xué)的新型疫苗研制提供了重要的分子工具。
　　由于多個(gè)弱毒疫苗毒株的大量應(yīng)用，導(dǎo)致疫苗毒與流行毒的重組事件頻繁發(fā)生，新的變異毒株不斷出現(xiàn)，成為當(dāng)前我國(guó)PRRS防控中存在的主要問(wèn)題。研制能區(qū)分疫苗免疫和自然野毒感染的標(biāo)記疫苗已成為當(dāng)前PRRS防控的重要技術(shù)需求。研究表明，NSP2是PRRSV變異程度最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，中間高變區(qū)存在不連續(xù)的缺失，而且

5、存在多個(gè)具有免疫優(yōu)勢(shì)的B細(xì)胞表位，是研制表位缺失標(biāo)記疫苗的候選區(qū)域，因此，本研究在PRRSV/GSWW/15株感染性克隆的基礎(chǔ)上，采用融合PCR方法構(gòu)建一系列NSP2中間高變區(qū)的缺失突變體，探究不同區(qū)域缺失對(duì)病毒復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，NSP2298-592、726-819、421-565、300-467、324-467、734-797位氨基酸缺失不能拯救到病毒，519-565位氨基酸缺失病毒復(fù)制能力顯著下降，NSP2421-467位氨基