低強度脈沖式超聲波（LIPU）對體外兔BMSCs的生物學效應及作用機制研究.pdf

1、關節(jié)軟骨損傷是臨床常見疾患,由于其無神經(jīng)支配、缺乏血液供應、軟骨細胞增殖遷移能力低等組織學特點,關節(jié)軟骨自身修復能力非常有限,損害后易出現(xiàn)不可逆的關節(jié)功能障礙,因此關節(jié)軟骨損傷的治療是運動醫(yī)學研究的熱點和難點之一。目前實驗和臨床研究證實應用軟骨下骨板鉆孔或微骨折等技術,可使骨髓腔內未分化的間充質細胞(BMSCs)遷移到缺損區(qū),并增殖、分化形成類透明軟骨組織,盡管遠期效果不理想,但也顯示了關節(jié)軟骨組織在特定的條件下具有一定的修復能力。因此

2、提高骨髓間充質干細胞向軟骨細胞定向分化能力并進一步改善新生軟骨的質量,可能是促進關節(jié)軟骨損傷修復的有效途徑之一。而近年來的研究表明低強度脈沖超聲(LowIntensity Pulsed Ultrasound)能促進骨折、骨不連的愈合,其機制是加速了軟骨的形成及軟骨內骨化。也有動物實驗研究報道,低強度脈沖超聲波具有促進關節(jié)骨-軟骨缺損修復的作用。然而目前關于LIPU對BMSCs等生物學效應及作用機制仍缺乏了解,臨床應用缺乏足夠的理論和實驗

3、依據(jù)。本課題擬通過構建BMSCs-軟骨細胞的藻酸鹽三維共培養(yǎng)體系,予以不同強度LIPU刺激,觀察BMSCs的增殖能力、細胞表型及合成分泌細胞外特異性基質、細胞調控因子水平的變化,從細胞、分子生物等層面探討LIPU對BMSCs的生物學效應及可能的作用機制。 目的： 構建BMSCs、軟骨細胞的藻酸鹽三維共培養(yǎng)體系,探討軟骨細胞的體外三維培養(yǎng)微環(huán)境對BMSCs增殖、成軟骨分化的影響；對體外BMSCs-軟骨細胞三維共培養(yǎng)體系施加

4、LIPU刺激,觀察細胞生物學改變情況,探討LIPU對BMSCs的生物學效應及作用機制,為LIPU在臨床中的進一步合理應用提供理論和實驗依據(jù)。 方法： 1.采用機械粉碎結合酶消化法獲取兔關節(jié)軟骨細胞,通過體外平面培養(yǎng)擴增、傳代,應用細胞形態(tài)學、II型膠原免疫組化染色鑒定細胞表型。 2.采用密度梯度離心結合貼壁篩選法從兔骨髓組織中分離、純化BMSCs,進行體外平面培養(yǎng)擴增,應用免疫組化染色、流式細胞儀分析細胞表面標志

5、物等方法對細胞表型、純度進行鑒定。 3.采用藻酸鹽凝膠復合軟骨細胞、BMSCs構建三維共培養(yǎng)體系,通過細胞計數(shù)、繪制生長曲線、H-E染色和II型膠原免疫組化染色等觀察藻酸鹽三維凝膠中細胞生物學性狀的變化。 4.對BMSCs、軟骨細胞的藻酸鹽凝膠三維共培養(yǎng)體系予以強度為2mW/cm2、10mW/cm2、30mW/cm2的LIPU刺激,觀察細胞形態(tài)、細胞增殖及表型的變化；應用II型膠原免疫組化染色法、甲苯胺藍染色法檢測細胞基

6、質中Ⅰ型、Ⅱ型、X型膠原及蛋白多糖蛋白合成分泌情況：應用RT-PCR法檢測細胞aggrecan與I型、Ⅱ型、X型膠原mRNA的表達情況；應用RT-PCR、Western-bloting法檢測細胞分化調控因子TGF-β1、IGF-I、bFGF的表達情況。 結果： 1.原代及第1-3代軟骨細胞貼壁后呈多角形,細胞形態(tài)、大小相近,融合區(qū)細胞呈典型的鋪路石狀,Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性,顯示其具有分泌軟骨細胞特征性基質Ⅱ型膠原的能

7、力。 2.培養(yǎng)的BMSCs貼壁能力很強,細胞形態(tài)為短梭形或紡錘形,細胞形態(tài)、大小相近；采用免疫細胞化學檢查發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的第1-3代細胞表達細胞表面抗原CD29、CD44、CD105,不表達CD14、CD34、CD45;同時,Ⅱ型、X型膠原免疫組化染色陰性,顯示所培養(yǎng)的細胞為未分化的BMSCs。 3.藻酸鹽凝膠具有一定的彈性和強度及良好的組織相容性,軟骨細胞、BMSCs在藻酸鹽凝膠中具有良好的生物學活性；免疫組化鑒定發(fā)現(xiàn)與軟骨

8、細胞共培養(yǎng)的BMSCs的Ⅱ型膠原染色陽性,而對照組為陰性,說明體外軟骨細胞三維培養(yǎng)微環(huán)境可誘導BMSCs定向分化成軟骨細胞。 4.LIPU不影響B(tài)MSCs的活性；可促進BMSCs增殖并合成軟骨組織特異性細胞外基質,其效應與超聲波的強度相關。強度為2mW/cm2、10mW/cm2的LIPU促進BMSCs向軟骨細胞轉化,增加II型膠原、蛋白多糖合成分泌,上調TGF-β1、IGF-I mRNA表達。強度為30mW/cm2的LIPU促進

9、BMSCs向肥大軟骨細胞轉化,增加Ⅱ型、X型膠原、蛋白多糖合成分泌增加,上調TGF-β1、IGF-I、bFGF mRNA表達。 結論： 1.通過機械粉碎酶消化法可獲取關節(jié)軟骨細胞,經(jīng)單層傳代培養(yǎng)擴增可在短時間內獲得足量、純化的、具有良好生物學活性兔關節(jié)軟骨細胞。 2.通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法可分離、純化骨髓間充質干細胞,經(jīng)過體外單層培養(yǎng)擴增可獲得成分單一、未分化的BMSCs。該方法簡便有效,分離、純化效果較

10、理想,收獲的第1至第3代BMSCs可作為后續(xù)實驗研究的種子細胞。 3.軟骨細胞-藻酸鹽凝膠與BMSCs-藻酸鹽凝膠在體外共培養(yǎng)可成功誘導BMSCs分化成軟骨細胞,提示除了傳統(tǒng)添加生長因子的誘導方法以外,與同類細胞共培養(yǎng)的方法可能是更經(jīng)濟而有效的干細胞誘導分化方法。 4.LIPU具有促進BMSCs增殖的作用,強度為30mW/cm2 LIPU的效應最為明顯。LIPU刺激可促進BMSCs向軟骨細胞分化。2mW/cm2組、10m

11、W/cm2組可促進BMSCs增殖,誘導其分化成軟骨細胞,以Ⅱ型膠原明顯增加為特征；30mW/cm2組可明顯促進BMSCs增殖,誘導其分化成肥大軟骨細胞,以X型膠原明顯增加為特征,長時間刺激可進一步誘導分化為成骨細胞。 5.LIPU作用于細胞后產(chǎn)生獨特的空泡效應、機械效應和溫熱效應,通過影響細胞骨架結構、細胞膜的通透性或通過第二信使系統(tǒng)來發(fā)揮作用,改變細胞調控因子TGF-β1、IGF-I、bFGF等基因表達,再通過細胞自分泌、旁分