低強(qiáng)度脈沖式超聲波(LIPU)與轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)聯(lián)合應(yīng)用對體外三維培養(yǎng)兔BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、目的： 1．構(gòu)建BMSCs-藻酸鹽天然材料三維支架，觀察BMSCs在立體培養(yǎng)條件下的生長情況、增殖能力、與平面培養(yǎng)條件下的差異； 2．通過一定濃度梯度的TGF-B1作用于三維培養(yǎng)條件下的BMSCs，觀察其生長及增殖情況、軟骨細(xì)胞分化能力，探索BMSCs三維培養(yǎng)條件下TGF-B1作用的最適濃度； 3．探索LIPU作用于BMSCs-藻酸鹽三維培養(yǎng)體系，促軟骨細(xì)胞分化的最佳強(qiáng)度。 4．探索LIPU與TGF-B1

2、共同作用對BMSCs的增殖、分化影響及促軟骨細(xì)胞分化能力。 5．探討LIPU與TGF-B1共同作用對BMSCs的增殖、分化協(xié)同作用，及可能的分子生物學(xué)機(jī)制。 方法： 1．采用梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過原代及傳代培養(yǎng)、擴(kuò)增，應(yīng)用免疫組化染色對BMSCs的表型進(jìn)行鑒定； 2．構(gòu)建BMSCs-藻酸鹽天然支架材料三維培養(yǎng)體系，大體觀察，倒置顯微鏡觀察BMSCs的生長情況，增殖能力，繪

3、制細(xì)胞生長曲線； 3．對BMSCs-藻酸鹽三維培養(yǎng)凝珠在一定作用時間內(nèi)，施加強(qiáng)度為2 mW/cm2、10mW/cm2、30 mw/cm2的LIPU刺激，通過大體觀察、生長曲線繪制、HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型、Ⅹ型膠原免疫組化染色，觀察不同強(qiáng)度的LIPU刺激對BMSCs的增殖、分化能力的影響； 4．通過濃度梯度為0、5、10、40 ng/ml TGF-B1作用于BMSCs-藻酸鹽三維培養(yǎng)凝珠，通過大體觀察、生長曲線繪制、

4、HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察不同濃度的TGF-β1對三維培養(yǎng)條件下BMSCs的增殖、分化能力的影響； 5．通過前兩步實驗得到的LIPU刺激最適強(qiáng)度及TGF-β1作用最佳濃度，最后將對兩種因素共同作用于BMSCs-藻酸鹽凝珠，通過大體觀察、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色、Realtime-PCR檢測與細(xì)胞增殖、促軟骨細(xì)胞分化相關(guān)的Coll-Ⅰ、Coll-Ⅱ、Coll-Ⅹ和aggrecan、TGF-β1RⅠ、

5、TGF-β1RⅡmRNA的相對表達(dá)，觀察兩者共同作用有無協(xié)同作用 結(jié)果： 1．通過梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離方法獲得BMSCs，經(jīng)鑒定為未分化的BMSCs； 2．BMSCs-藻酸鹽培養(yǎng)體系為半透明親水性凝膠，BMSCs可以保持良好的生物學(xué)形態(tài)，培養(yǎng)第7-21天細(xì)胞增殖明顯，較平面培養(yǎng)獲得更多的細(xì)胞量，為BMSCs提供良好的生長微環(huán)境； 3．強(qiáng)度為30mW/cm2的LIPU可以促進(jìn)BMSCs增殖，強(qiáng)度為10

6、mW/cm2的LIPU可以促進(jìn)BMSCs表達(dá)Ⅱ型膠原，各組Ⅹ型膠原染色均為陰性，說明上述強(qiáng)度的LIPU刺激均未導(dǎo)致BMSCs分化為肥大軟骨細(xì)胞： 4．濃度為10 ng/ml的TGF-β1可以更好的誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，說明在三維培養(yǎng)條件下TGP-β1作用的最適濃度與多數(shù)文章報道的平面培養(yǎng)最適濃度10 ng/ml一致； 5．LIPU10 mw/cm2+TGF-β110ng/ml組Ⅱ型膠原免疫組化染色呈強(qiáng)陽性表達(dá)，L

7、IPU10 mw/cm2+TGF-β110ng/ml組aggrecan、Coll-Ⅱ基因的mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，較單獨應(yīng)用一種方法有效，有統(tǒng)計學(xué)意義；TGF-β1可以同時上調(diào)TGF-β1RⅠ及基因的TGF-β1RⅡ基因mRNA表達(dá)，上述兩種受體基因的表達(dá)與Ⅱ型膠原及aggrecan基因表達(dá)則增加存在一定相關(guān)性。TGF-β1及LIPU均可以上調(diào)aggrecan、CollagenⅡ基因的表達(dá)，但LIPU并不能上調(diào)TGF-β1RⅠ及TGF-

8、β1RⅡ基因mRNA表達(dá)。 結(jié)論： 1．采用密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法可以有效分離、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過體外單層培養(yǎng)擴(kuò)增可獲得成分單一、未分化的BMSCs。 2．BMSCs-藻酸鹽三維培養(yǎng)體系是一種具有良好安全性、可靠性的組織工程支架，較平面培養(yǎng)能夠獲得更多的種子細(xì)胞，減少因平面培養(yǎng)引起的細(xì)胞生長抑制現(xiàn)象，為細(xì)胞的生長提供了良好的微環(huán)境。 3．在一定時間內(nèi)，強(qiáng)度為30mW/cm2的LIPU可以促進(jìn)B

9、MSCs增殖，強(qiáng)度為10mW/cm2的LIPU可以促進(jìn)BMSCs的Ⅱ型膠原表達(dá)，各組X型膠原染色均為陰性，說明30mW/cm2以內(nèi)的LIPU刺激強(qiáng)度并未導(dǎo)致BMSCs分化為肥大軟骨細(xì)胞。 4．濃度為10 ng/ml的TGF-β1可以更好的誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，說明在三維培養(yǎng)條件下TGF-β1作用的最適濃度與多數(shù)文章報道的平面培養(yǎng)最適濃度10 ng/ml一致。 5．TGF-β1可以同時上調(diào)TGF-βBRⅠ及基因的T

10、GF-β1RⅡ基因mRNA表達(dá)，上述兩種受體基因的表達(dá)與Ⅱ型膠原及aggrecan基因表達(dá)則增加存在一定相關(guān)性。TGF-β1及LIPU均可以上調(diào)aggrecan、CollagenⅡ基因的表達(dá)，但LIPU并不能上調(diào)TGF-β1RⅠ及TGF-β1RⅡ基因mRNA表達(dá)，其結(jié)果符合生長因子是細(xì)胞作用信號傳導(dǎo)過程中，增加TGF-β1Ⅰ、Ⅱ型受體表達(dá)的增加而改善細(xì)胞功能、促進(jìn)細(xì)胞分化，而LIPU則是通過細(xì)胞的力學(xué)刺激信號傳導(dǎo)通路改善細(xì)胞功能，促進(jìn)細(xì)