低強度脈沖超聲波對大鼠脂肪干細胞增殖和成骨分化的影響及成骨機制的初步研究.pdf

1、本文內(nèi)容主要分為四部分：
　　第一部分SD大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：從 SD大鼠脂肪組織中分離得到間質(zhì)干細胞,為后續(xù)研究提供種子細胞。
　　方法：
　　1.從 SD大鼠的腹股溝部位切取脂肪組織,結合酶消化法獲得一群細胞。
　　2.經(jīng)免疫磁珠系統(tǒng)分選后體外培養(yǎng),觀測其形態(tài)學特征及鑒定細胞表面標記。
　　結果：
　　1.獲取的細胞呈現(xiàn)類成纖維細胞樣,可在體外穩(wěn)定擴增傳代。
　

2、　2.獲取的細胞表面標志符合目前公認的間質(zhì)干細胞表型特征。
　　結論：通過機械分離結合酶消化的方法,經(jīng)分選后成功獲得 SD大鼠ADSCs,可體外培養(yǎng),為后續(xù)研究提供種子細胞。
　　第二部分LIPUS對大鼠ADSCs增殖和成骨分化的影響
　　目的：探討 LIPUS對體外分離培養(yǎng)的大鼠ADSCs增殖及成骨分化的影響。
　　方法：
　　1.流式細胞儀檢測陰性對照組和LIPUS組中1d、2d、3d、4d和5d時 A

3、DSCs細胞周期分布,計算增殖指數(shù)。
　　2.CCK-8法檢測陰性對照組和LIPUS組1d、3d、5d和7d時細胞計數(shù),比較增殖程度。
　　3.設置陰性對照組、LIPUS組、成骨誘導組及LIPUS聯(lián)合成骨誘導組,于 LIPUS刺激7d、14d時測定各組細胞堿性磷酸酶(ALP)活性;于 LIPUS刺激21d時采用Von kossa染色比較各組鈣結節(jié)形成。
　　4.RT-PCR檢測陰性對照組和LIPUS組1d、3d、5d和

4、7d時成骨相關基因(包括Runx2、ALP、OCN、BSP、Coll I)的表達。
　　5.Western blot檢測陰性對照組和LIPUS組7d和14d時成骨相關蛋白(包括 Runx2和BSP)的表達。
　　結果：
　　1.LIPUS組細胞增殖指數(shù)4d和5d時較對照組提高。
　　2.LIPUS組細胞增殖程度3d、5d和7d時較對照組加快。
　　3.LIPUS組 ALP活性7d或14d時較對照組提高,但低

5、于成骨誘導組及LIPUS聯(lián)合成骨誘導組;成骨誘導組與 LIPUS聯(lián)合成骨誘導組間差異無統(tǒng)計學意義;另外各組細胞 ALP活性測定結果在上述2個時間點間組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學意義。LIPUS作用能致 ADSCs形成礦化結節(jié),但其礦化結節(jié)數(shù)量不及成骨誘導組和LIPUS聯(lián)合成骨誘導組。
　　4.LIPUS組3d、5d或7d后,Runx2和ALP mRNA的表達增加;5d或7d后, LIPUS組 BSP和OCN mRNA也表達增加;沒有觀察到

6、Coll I mRNA的改變。
　　5.LIPUS作用7d和14d后,Runx2和BSP蛋白表達量均增加,BSP蛋白表達的增加從7d維持到14d。但14d后 Runx2蛋白量較7d時稍有下調(diào)。
　　結論：LIPUS能加速大鼠ADSCs增殖,促進大鼠ADSCs向成骨細胞分化。
　　第三部分β-catenin shRNA慢病毒載體構建和沉默β-catenin基因效果檢測
　　目的：構建慢病毒載體,沉默大鼠脂肪源干細胞

7、β-catenin基因表達,為分析經(jīng)典的Wnt通路在 LIPUS促進大鼠ADSCs成骨分化中的作用提供基礎。
　　方法：
　　1.針對大鼠ADSCs的β-catenin基因設計出3種 shRNA打靶序列,分別構建3種 pCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染至大鼠ADSCs,篩選出最有效的shRNA打靶序列。
　　2.構建含有該 shRNA序列的慢病毒載體。
　　3.用慢病毒載體轉(zhuǎn)染

8、大鼠ADSCs。
　　4.檢測慢病毒載體轉(zhuǎn)染后,沉默β-catenin基因的效果。
　　結果：
　　1.用質(zhì)粒載體篩選出有效的β-catenin基因 shRNA序列。
　　2.用構建病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs后,可有效沉默β-catenin基因。
　　結論：一種較為經(jīng)濟的方法,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,沉默大鼠脂肪源干細胞β-catenin基因。藉此可分析經(jīng)典的Wnt通路在 LIPUS促進大鼠ADSCs成骨分化中的作用。<

9、br>　　第四部分經(jīng)典 Wnt信號通路在 LIPUS促進大鼠ADSCs成骨分化中的作用
　　目的：初步探討經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路在 LIPUS促進大鼠ADSCs成骨分化過程中的作用。
　　方法：
　　1.Real-time PCR檢測正常 ADSCs組、未轉(zhuǎn)染刺激組、轉(zhuǎn)染刺激組1d、3d、5d和7d時成骨相關基因(包括 Runx2、ALP、BSP、Coll I)的表達;
　　2.Western

10、blot檢測正常 ADSCs組、未轉(zhuǎn)染刺激組、轉(zhuǎn)染刺激組7d和14d時成骨相關蛋白(包括 Runx2和BSP)的表達。
　　結果：
　　1.正常的ADSCs在不接受 LIPUS刺激的情況下,所有基因基本呈現(xiàn)一致表達。
　　2.未轉(zhuǎn)染刺激組3d、5d和7d后 Runx2基因的表達出現(xiàn)上調(diào);轉(zhuǎn)染刺激組3d、5d和7d后 Runx2基因的表達也同樣出現(xiàn)上調(diào),但上調(diào)的幅度下降。
　　3.未轉(zhuǎn)染刺激組3d、5d和7d后出現(xiàn)

11、 ALP基因表達的上調(diào);轉(zhuǎn)染刺激組3d、5d和7d后也同樣出現(xiàn)較一致的上調(diào),上調(diào)的幅度無下降。
　　4.未轉(zhuǎn)染刺激組5d和7d后出現(xiàn) BSP基因的上調(diào)表達;轉(zhuǎn)染刺激組5d和7d后也同樣出現(xiàn)上調(diào),但上調(diào)的幅度有所下降。
　　5.而三組之間,I型膠原基因的表達始終沒有明顯的變化。
　　6.未轉(zhuǎn)染刺激組和轉(zhuǎn)染刺激組在7d和14d后,均出現(xiàn) Runx2蛋白的表達水平增加,但14d后增幅稍低;轉(zhuǎn)染刺激組與未轉(zhuǎn)染刺激組相比,7d時