Cr(Ⅵ)致A549細(xì)胞毒性中hMLH1 hMSH2 P53的表達(dá)變化.pdf

1、鉻(Chromium,Cr)主要用于工業(yè)生產(chǎn)涂料,染料,油墨；鍍鉻,皮革鞣制；及木材貯存等。研究顯示工人長期接觸Cr(Ⅵ)可誘發(fā)肺癌。
　　 有研究表明,在活體細(xì)胞內(nèi)90％的抗壞血酸(ascorbate,Asc)參與Cr(Ⅵ)的還原代謝,且Asc是Cr(Ⅵ)的主要還原劑。在體外實(shí)驗(yàn)中Asc含量非常低,脫氫抗壞血酸(dehydroascrobate acid,DHA)孵育使細(xì)胞內(nèi)Asc達(dá)到或接近機(jī)體的正常生理濃度。Reynolds

2、等發(fā)現(xiàn)在對(duì)H460和IMR90細(xì)胞孵育DHA90 min后,再用Cr(Ⅵ)染毒細(xì)胞,細(xì)胞急性毒性增強(qiáng)。Takahashi等研究認(rèn)為hMLH1和hMSH2基因在鉻酸鹽接觸者肺癌患者的失活率高于非鉻酸鹽接觸者肺癌患者的失活率。
　　 目的:
　　 探討DHA在Cr(Ⅵ)致細(xì)胞損傷中的作用,為進(jìn)一步研究Cr(Ⅵ)致癌及預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.孵育用DHA濃度為0.6 mmol/L的無血清培養(yǎng)

3、液。DHA先溶于DMSO,DMSO在無血清培養(yǎng)液中的體積分?jǐn)?shù)為0.2％。Cr(Ⅵ)染毒液由重鉻酸鉀配制。實(shí)驗(yàn)分組為陰性組、溶劑組、實(shí)驗(yàn)組A和實(shí)驗(yàn)組B。陰性組為空白對(duì)照組,溶劑組為儀DHA溶液孵育90 min未有Cr(Ⅵ)處理組,實(shí)驗(yàn)組A為單獨(dú)Cr(Ⅵ)處理組,實(shí)驗(yàn)組B為DHA孵育90 min后Cr(Ⅵ)處理組。
　　 2.DHA孵育后對(duì)A549細(xì)胞生長曲線的影響。實(shí)驗(yàn)分組為陰性組、溶劑組、實(shí)驗(yàn)組A和實(shí)驗(yàn)組B,共觀察6 d。Cr(

4、Ⅵ)染毒濃度為10μmol/L處理時(shí)間為3 h。
　　 3.DHA孵育后對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。Cr(Ⅵ)以0.00、1.25、2.50、5.00μmol/L染毒A549細(xì)胞24 h,分析實(shí)驗(yàn)組A、B的細(xì)胞增殖的影響。
　　 4.DHA孵育后對(duì)hMLH1、hMSH2、p53表達(dá)的影響。以Cr(Ⅵ)0.00、1.25、2.50、5.00μmol/L染毒A549細(xì)胞24 h,提取總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR

5、(real time PCR)分析,檢測hMLH1、hMSH2、p53 mRNA的表達(dá)水平。
　　 5.Western blot方法檢測Cr(Ⅵ)作用24 h后hMSH2在蛋白水平上的表達(dá)情況。使用Bioimaging System成像分析系統(tǒng)掃面,Gene Tool軟件分析蛋白表達(dá)情況。
　　 6.運(yùn)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件,Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)、Levene方差齊性檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和單因素方差

6、分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用Pearson相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05)。
　　 結(jié)果：
　　 1.陰性組和溶劑組A549細(xì)胞生長狀況良好,在第4 d達(dá)到,上長高峰,隨后出現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象；實(shí)驗(yàn)組A、B中A549細(xì)胞增殖被六價(jià)鉻抑制,與陰性組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組A、B比較,實(shí)驗(yàn)組B中A549細(xì)胞增殖抑制程度更強(qiáng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)組A、B的抑制率有差別,

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組A、B的IC50分別為:13.04μmol/L和3.34μmol/L,二者的急性毒性之比約為1:4。
　　 3.實(shí)驗(yàn)組B基因mRNA相對(duì)表達(dá)量低于實(shí)驗(yàn)組A,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.實(shí)驗(yàn)組BhMSH2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于實(shí)驗(yàn)組A,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在實(shí)驗(yàn)組B中,隨染毒劑量增加hMSH2蛋白表達(dá)降低；實(shí)驗(yàn)組A中hMSH2蛋白的表達(dá)在Cr(Ⅵ)濃度為1.25μmo

8、l/L時(shí)較0.00μmol/L時(shí)升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),在2.50～5.00μmol/L時(shí),隨染毒劑量增加,蛋白表達(dá)降低,與0.00μmol/L比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.DHA在Cr(Ⅵ)致細(xì)胞毒性中起到了促進(jìn)作用。
　　 2.hMLH1、hMSH2和p53在A549細(xì)胞中mRNA的農(nóng)達(dá)及hMSH2蛋白的表達(dá)在低劑量Cr(Ⅵ)染毒時(shí)表達(dá)升高,在高劑量Cr(Ⅵ)染毒時(shí)