海馬膽堿能神經(jīng)刺激肽及其前體蛋白對胰島β細(xì)胞影響與利拉魯肽作用相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 目前，中國已成為世界第一糖尿病大國，2008年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會(CDS)組織的糖尿病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在20歲以上的人群中，年齡標(biāo)化的糖尿病患病率為9.7％，而糖尿病前期的比例高達(dá)15.5％。糖尿病前期是糖尿病高危人群，約60％糖尿病患者來自此人群。
　　 2型糖尿病的病理生理機(jī)制呈復(fù)雜及多方面性，2008年Banting獎(jiǎng)獲得者Defrozon教授總結(jié)近年研究進(jìn)展，提出胰島β細(xì)胞分泌缺

2、陷、肌肉組織葡萄糖攝取減少、肝糖輸出增加、脂毒性、腸促胰島激素減少、α細(xì)胞分泌胰高血糖素增多、腎小管重吸收葡萄糖增加及中樞對葡萄糖攝取的抑制反應(yīng)下降8種2型糖尿病發(fā)病相關(guān)的病理生理機(jī)制。這些因素導(dǎo)致機(jī)體對葡萄糖攝取及儲存、處理能力下降。而早在糖耐量減低階段，胰島β細(xì)胞數(shù)量已有明顯下降，在確診2型糖尿病時(shí)，胰島β細(xì)胞數(shù)量下降可達(dá)60％，功能喪失可達(dá)80％。因此針對胰島β細(xì)胞增殖、凋亡及分泌功能的研究至關(guān)重要。
　　 大量研究業(yè)已證

3、實(shí)，神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿可激活胰島β細(xì)胞膜3型毒蕈堿樣膽堿能受體(type3 muscarinicacetylcholine receptors，M3R)，進(jìn)而作用于磷酸肌醇—蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)途徑引起胰島素分泌的擴(kuò)增。而應(yīng)用佛泊酯(Phorbol12-myristate13-acetate，PMA)直接興奮PKC后，反而引起β細(xì)胞鈣離子外流，抑制胰島素釋放，抑制乙酰膽堿擴(kuò)增胰島素釋放作用。在中樞海馬組

4、織，海馬膽堿能神經(jīng)刺激肽前體蛋白（Hippocampal Cholinergic Neurostimulating Peptideprecursorprotein，HCNP-pp）經(jīng)類糜蛋白酶裂解為HCNP。HCNP是含有11個(gè)氨基酸殘基的多肽，可通過激活膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶（Cholineacetyltransferase，ChAT）促進(jìn)乙酰膽堿合成，進(jìn)而活化膽堿能神經(jīng)受體系統(tǒng)。然而，HCNP對胰島β細(xì)胞是否具有提高ChAT活性、活化M3

5、R，進(jìn)而促胰島素分泌，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 HCNP-pp廣泛存在于組織細(xì)胞中，又稱為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidyl-ehanolamine-bindingprotein,PEBP）及raf-1激酶抑制蛋白(Raf-1kinaseinhibitorprotein，RKIP)。它可抑制raf-1激酶磷酸化，進(jìn)一步抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號

6、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，抑制細(xì)胞增殖。已有研究證實(shí)，MAPK在胰島β細(xì)胞增殖、分化中起重要作用，HCNP-pp特異地存在胰島β細(xì)胞，作為Raf-1特異性抑制劑，可抑制β細(xì)胞增殖。然而，糖尿病狀態(tài)下胰島HCNP-pp含量如何變化，是否與β細(xì)胞增殖能力下降相關(guān)，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 胰高血糖素樣多肽-1(Glucagon-likepeptide-1，GLP-1)在“腸—胰島軸”中起重要作用。它作用于β細(xì)胞上G蛋白偶聯(lián)的特異性受體，不但通

7、過環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A途徑起“腸促胰島素”作用，還與乙酰膽堿協(xié)同作用活化膽堿能神經(jīng)受體引起胰島素分泌。此外，細(xì)胞培養(yǎng)及動物實(shí)驗(yàn)業(yè)已證實(shí)GLP-1可激活MAPK通路，促進(jìn)β細(xì)胞增殖。利拉魯肽作為人胰高血糖素樣多肽-1類似物，在促進(jìn)胰島素分泌及促進(jìn)β細(xì)胞增殖均有明顯作用，可能成為治療糖尿病前期理想藥物。然而利拉魯肽是否可阻抑糖尿病前期的進(jìn)展，利拉魯肽的上述作用是否與HCNP及其前體蛋白相關(guān)，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 綜上所述，本課

8、題以β細(xì)胞株INS-1細(xì)胞及糖尿病前期OLETF大鼠為研究對象，從以下兩個(gè)方面進(jìn)行相關(guān)研究:1，觀察HCNP對INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響;通過對ChAT、M3R基因水平檢測，探討HCNP對INS-1細(xì)胞作用的相關(guān)途徑。2，觀測利拉魯肽干預(yù)的糖尿病前期OLETF大鼠胰島β細(xì)胞增殖及胰島素分泌的變化;進(jìn)一步對不同狀態(tài)的OLETF大鼠胰島細(xì)胞HCNP-pp、HCNP及GLP-1R的蛋白、基因水平進(jìn)行檢測，同時(shí)檢測ChAT及M3R基因表達(dá)，

9、探究利拉魯肽影響胰島增殖、胰島素釋放的可能機(jī)制。
　　 第一部分HCNP對INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響
　　 目的:
　　 探討HCNP對INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響及可能的作用途徑
　　 方法:
　　 (1)HCNP合成及純度檢測:應(yīng)用固相化學(xué)合成技術(shù)人工合成含11個(gè)氨基酸殘基的多肽，序列為:H-Ala-Ala-Asp-Ile-Ser-Gln-Trp-Ala-Gly-Pro-Leu-OH.采

10、用反向高效液相色譜及電噴霧質(zhì)譜法對產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。
　　 (2)INS-1細(xì)胞的培養(yǎng)及活性鑒定:以含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基及在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察生長情況。
　　 (3)胰島素釋放實(shí)驗(yàn):80％INS-1細(xì)胞融合成片時(shí)，應(yīng)用0.1％胰酶及0.1％EDTA混合液消化、吹散。接種于6孔板中，每孔6×105個(gè)細(xì)胞。隨機(jī)分為3組:對照組、HCNP組、HCNP+PMA組。對照

11、組INS-1細(xì)胞給予RPMI1640液培養(yǎng)，HCNP組INS-1細(xì)胞給予人工合成HCNP50pg/ml與RPMI-1640液共培養(yǎng)，HCNP+PMA組INS-1細(xì)胞予人工合成HCNP50pg/ml與RPMI-1640液共培養(yǎng)并在行胰島素釋放實(shí)驗(yàn)前加10nMPMA培養(yǎng)18小時(shí)。將各組INS-1細(xì)胞置于5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后棄上清，含3.3mmol/L葡萄糖KRBH液預(yù)培養(yǎng)40min，提取上清液，測定胰島素濃度。3.0mlKRBH液再

12、次沖洗后依次加含5.6、16.7mmol/L葡萄糖及新斯的明20μmol/L、氯化膽堿100μmol/L的KRBH液培養(yǎng)40min收集上清液，放射免疫分析方法測定胰島素含量。
　　 (4)qRT-PCR檢測ChAT及M3R基因表達(dá)水平:80％INS-1細(xì)胞融合成片時(shí)，應(yīng)用0.1％胰酶及0.1％EDTA混合液消化、吹散。接種于6孔板中，每孔6×105個(gè)細(xì)胞。隨機(jī)分為對照組及HCNP組;INS-1細(xì)胞經(jīng)Trizol液裂解，按說明書提

13、取總RNA，-80℃保存。設(shè)計(jì)ChAT、M3R基因mRNA序列的特異性引物，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測ChAT及M3R基因表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 (1)在葡萄糖濃度為3.3mmol/L、5.6mmol/L及16.7mmol/L細(xì)胞培養(yǎng)上清液胰島素含量。3.3mmol/L時(shí)，對照組、HCNP組及HCNP+PMA組分別為8.36±0.97、8.27+0.79、7.94±0.97μIU/ml;5.6mmol/L時(shí)，

14、對照組、HCNP組及HCNP+PMA組分別為8.48±0.92、10.09±1.41、8.36±1.05μIU/ml;16.7mmol/L時(shí)，對照組、HCNP組及HCNP+PMA分另為8.73±0.75、10.82±1.32、8.88±1.01μIU/ml。當(dāng)葡萄糖濃度為3.3mmol/L時(shí)，HCNP組胰島素含量較對照組及HCNP+PMA組無顯著變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.535，P=0.592);葡萄糖濃度達(dá)5.6mmol/L時(shí)，

15、HCNP組胰島素含量較對照組及HCNP+PMA組均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.340，P=0.006);同樣，給予16.7mmol/L葡萄糖刺激INS-1細(xì)胞時(shí)，HCNP組胰島素含量較對照組及HCNP+PMA組均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.836，P＜0.001)。
　　 (2)HCNP處理組ChAT(3.01±0.47×105拷貝)及M3R(1.06±0.18)兩者mRNA含量顯著升高，對照組兩者含量分別為:1.

16、01±0.30、0.72±0.15;兩組相比，ChAT、M3R基因表達(dá)水平的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ChAT(t=-8.837，P＜0.001),M3R(t=-3.546,P=0.005)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)在3.3mmol/L葡萄糖濃度時(shí)，HCNP對INS-1細(xì)胞的胰島素釋放無明顯作用，而在5.6mmol/L及16.7mmol/L葡萄糖濃度下，HCNP可促進(jìn)INS-1細(xì)胞胰島素釋放，佛波酯可抑制HCNP此作用，

17、提示HCNP作用可能通過PKC途徑促進(jìn)胰島素釋放。
　　 (2)HCNP組ChAT、M3R基因表達(dá)水平均高于對照組，提示HCNP促進(jìn)胰島素釋放作用與INS-1細(xì)胞增高的ChAT、M3R基因表達(dá)相關(guān)。
　　 第二部分利拉魯肽干預(yù)的糖尿病前期OLETF大鼠胰島細(xì)胞HCNP-pp、HCNP變化對胰島β細(xì)胞功能、增殖的影響
　　 目的:
　　 觀測不同劑量利拉魯肽干預(yù)的糖尿病前期OLETF大鼠HCNP-pp及HC

18、NP變化對口服葡萄糖耐量試驗(yàn)、早期胰島素分泌指數(shù)及胰島素陽性細(xì)胞密度的影響，探究GLP-1R與HCNP-pp、HCNP的相關(guān)性。
　　 方法:
　　 (1)OGTT試驗(yàn)、早期胰島素分泌指數(shù)及胰島素陽性細(xì)胞表達(dá)密度檢測:雄性4周齡OLETF大鼠飼養(yǎng)8-10周后，禁食15小時(shí)，行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（葡萄糖2g/kg，胃管灌入）葡萄糖氧化酶法分別檢測30、60、90、120分鐘鼠尾靜脈血糖，按國際慣用的大鼠糖尿病診斷參考標(biāo)準(zhǔn):

19、血糖峰值＞16.7mmol/L和糖負(fù)荷2小時(shí)血糖＞11.1mmol/L，符合其中之一為糖耐量減低(ImpairedGlucosetolerance，IGT)。將處于IGT階段的OLETF大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只;分別給予100μg/kg（L-100組）、200tg/kg（L-200組）利拉魯肽及生理鹽水1.0mL/kg（PBO組），一日兩次腹腔內(nèi)注射。LETO組大鼠給予生理鹽水1.0mL/kg腹腔內(nèi)注射。在給藥12周再次行OGTT試驗(yàn)

20、，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附方法檢測早期胰島素分泌指數(shù)（糖負(fù)荷后30min胰島素增量與葡萄糖增量的比值）即ΔIns30/ΔGlu30=(Ins30-FINS)/(Glu30-FPG);取胰腺行免疫組織化學(xué)染色檢測胰島素陽性細(xì)胞表達(dá)密度（Insulin-positivecellsdensity,Ins-PCD）。
　　 (2)胰島細(xì)胞HCNP-pp、ChAT、M3R及GLP-1RmRNA熒光定量分析:將胰島細(xì)胞應(yīng)用Trizol液裂解，按說明

21、書提取總RNA，-80℃保存。qRT-PCR法測定胰島HCNP-ppmRNA、ChATmRNA、M3RmRNA及GLP-1RmRNA表達(dá)水平（單位均以×105拷貝表示，下同）。
　　 (3)胰島細(xì)胞HCNP-pp、GLP-1R蛋白表達(dá)分析:提取胰島細(xì)胞總蛋白，用Bradford法測定蛋白含量。以每毫升樣品中的毫克蛋白量(mg/ml)表示。Β-actin作為HCNP-pp的內(nèi)參照，采用Western印跡方法，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白

22、條帶，測定大鼠胰島CT-HCNP-pp、NT-HCNP-pp及GLP-1R蛋白的相對含量。
　　 結(jié)果:
　　 (1)OGTT試驗(yàn)、ΔIns30/ΔGlu30及Ins-PCD:經(jīng)12周利拉魯肽干預(yù)，PBO組大鼠空腹血糖(8.39±1.14mmol/L)、糖負(fù)荷2小時(shí)血糖(11.45±1.23mmol/L)均顯著高于L-100組(7.15±0.84，8.60±1.23)、L-200組(6.45±0.61，7.59±0.47

23、)及LETO組(7.15±0.84，8.60±1.23)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;大鼠空腹血糖(F=22.925，P＜0.001)，糖負(fù)荷2小時(shí)血糖(F=40.805，P＜0.001)。而ΔIns30/ΔGlu30（3.85±0.19）較L-100組（8.90±0.37）、L-200組(9.55±0.25)及LETO組(11.99±0.31)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.895，P＜0.001);同PBO組胰島素陽性細(xì)胞表達(dá)密度(0.

24、67±0.08，個(gè)/μm2)相比，L-100組(0.68±0.07)胰島素陽性細(xì)胞表達(dá)密度無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而L-200組(0.84±0.08，)、LETO組（0.90±0.08）胰島素陽性細(xì)胞表達(dá)密度顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.968，P＜0.001)。
　　 (2)大鼠胰島細(xì)胞HCNP-pp、GLP-1R、ChAT及M3R基因表達(dá)情況:與PBO組HCNP-ppmRNA(5.38±1.47)相比較，LE

25、TO組(3.07±0.80)、L-100組（3.58±0.79）及L-200組(3.32±0.65)相對表達(dá)水平下降;與PBO組ChATmRNA(0.85±0.21)、M3RmRNA(0.21±0.05)及GLP-1RmRNA(10.97±2.90)相比，LETO組(分別為:3.33±0.53,0.51±0.08,17.27±3.18)、L-100組(分別為:1.73±0.21,0.38±0.05,15.O2±3.36)及L-200組（

26、分別為:1.78±0.46,0.44±0.09,17.43±4.24）三者相對表達(dá)水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HCNP-ppmRNA(F=8.563,P＜0.001),ChATmRNA(F=55.106,P＜0.001),M3RmRNA(F=27.201,P＜0.001),GLP-1RmRNA(F=6.012,P=0.003)。
　　 (3)大鼠胰島細(xì)胞HCNP-pp、GLP-1R蛋白表達(dá)情況:與PBO組CT-HCNP-

27、pp(0.78±0.04)、NT-HCNP-pp(0.75±0.04)蛋白相對含量及NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp比值(0.96±0.O2)相比較，L-200組（分別為:0.66±0.04,0.53±0.02,0.85±0.04）及LETO組（分別為:0.68±0.05,0.57±0.06,0.84±0.07）均明顯減低，L-100組(分別為:0.73±0.02,0.69±0.01,0.95±0.02)NT-HCNP-pp/

28、CT-HCNP-pp比值與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與PBO組GLP-1R蛋白相對含量(0.64±0.04)相比，L-100組(0.76±0.03)、L-200組(0.80±0.03)及LETO組（0.81±0.07）均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CT-HCNP-pp(F=12.973,P＜0.001),NT-HCNP-pp(F=18.250,P＜0.001),NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp比值(F=17.632,P＜0.00

29、1),GLP-1R(F=20.467,P＜0.001)。
　　 (4)大鼠胰島細(xì)胞HCNP-pp與GLP-1R蛋白、基因表達(dá)相關(guān)性分析:不同組別大鼠胰島細(xì)胞CT-HCNP-pp(0.711±0.061)、NT-HCNP-pp(0.640±0.094)及NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp(0.897±0.071)與GLP-1R(0.750±0.083)蛋白相對水平呈負(fù)相關(guān);同樣，HCNP-ppmRNA(3.872±1.35

30、3)與GLP-1RmRNA(15.106±4.252)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。CT-HCNP-pp:y=-0.886X+1.380(R=0.649,t=-4.429,P＜0.001);NT-HCNP-pp:y=-0.623X+1.148(R=0.701,t=-5.107,P＜0.001);NT-HCNP-pp/CT-HCNP-ppy=-0.685X+1.364(R=0.582,t=-3.717,P=0.001);HCNP-ppmRNA:y=-

31、1.563X+2.11(R=0.498,t=-2.982,P＝0.006)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)利拉魯肽具有改善IGT階段OLETF大鼠血糖、早期胰島素分泌指數(shù)及胰島β細(xì)胞數(shù)量，可阻抑糖尿病前期的進(jìn)展。
　　 (2)安慰劑組OLETF大鼠12周后87.5％進(jìn)展為2型糖尿病狀態(tài);胰島細(xì)胞GLP-1R下降、HCNP-pp增多，HCNP減少。提示上述指標(biāo)變化與2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。
　　 (3)各