利拉魯肽對糖尿病小鼠認(rèn)知功能下降的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病是一種以慢性高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征，常伴有多尿多飲多食等臨床表現(xiàn)，其發(fā)病率逐年上升，已成為一種嚴(yán)重影響人民健康的全球性公共衛(wèi)生問題。糖尿病的慢性并發(fā)癥遍及全身各大重要臟器，作為糖尿病一種嚴(yán)重但卻容易被忽略的并發(fā)癥，糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能下降已經(jīng)逐漸引起人們的關(guān)注。但是，其潛在的發(fā)病機(jī)制及相應(yīng)的臨床干預(yù)措施仍不清楚。
　　自噬在細(xì)胞的存亡中起著重要的作用，并且和很多神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。自噬是否參與了糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能下降

2、，目前仍不清楚。鑒于糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能損害對患者生活質(zhì)量的嚴(yán)重影響，研究其潛在的發(fā)病機(jī)制，有助于我們更好的了解這種疾病，從而尋找更有效的治療措施和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。近年來越來越多的研究報道了利拉魯肽在各種實(shí)驗(yàn)動物模型和臨床退行性疾病中的潛在神經(jīng)保護(hù)作用。但是利拉魯肽對糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能下降的作用尚不十分明確。
　　本研究通過糖尿病動物在體模型和原代海馬神經(jīng)元離體培養(yǎng)，研究了糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能損傷的發(fā)病機(jī)制及其干預(yù)措施。我們的研究發(fā)

3、現(xiàn)，糖尿病引起了海馬神經(jīng)元的損傷和之后的認(rèn)知功能下降，而自噬參與其中，并起著一定的保護(hù)作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)利拉魯肽處理改善了糖尿病引起的神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能損害，同時，利拉魯肽通過AMPK/mTOR信號通路進(jìn)一步上調(diào)了自噬水平。因此，我們推測利拉魯肽通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路上調(diào)自噬，從而改善糖尿病引起的認(rèn)知功能下降。通過上述研究，我們揭示了利拉魯肽在糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能下降中潛在的神經(jīng)保護(hù)作用及其部分相關(guān)機(jī)制。
　　本研究

4、分為兩個部分:
　　第一部分:自噬在糖尿病引起的神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能下降中的作用;
　　第二部分:利拉魯肽通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路上調(diào)自噬改善糖尿病引起的認(rèn)知功能下降。
　　第一部分自噬在糖尿病引起的神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能下降中的作用
　　目的:
　　糖尿病是一種嚴(yán)重影響人民健康的全球性公共衛(wèi)生問題，并且其患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。作為糖尿病一種嚴(yán)重但卻容易被忽略的并發(fā)癥，糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能下降

5、已經(jīng)逐漸引起人們的關(guān)注。但是，其潛在的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來越來越多的研究指出自噬在細(xì)胞的存亡中起著重要的作用，并且自噬和很多神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。在這部分研究中，我們通過離體和在體實(shí)驗(yàn)旨在研究自噬在糖尿病引起的神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能損害中的作用。
　　方法:
　　健康SPF級6周齡雄性小鼠，隨機(jī)分為對照組(Con)和糖尿病組(DM)，每組15只。我們通過鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)一次性腹腔注射制備糖尿

6、病動物模型。糖尿病引起認(rèn)知功能下降的研究:STZ誘導(dǎo)糖尿病模型成功后，定期監(jiān)測小鼠血糖、體重、飲食量和飲水量;8W后通過曠場實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測糖尿病動物認(rèn)知功能的變化;通過HE染色觀察神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變;通過尼氏染色觀察神經(jīng)元數(shù)目的變化;通過透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元突觸和線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變;通過Western blot檢測海馬突觸蛋白Synaptophysin和PSD95及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3、

7、Bcl-2和Bax表達(dá)的改變。自噬在糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中作用的研究:通過Western blot檢測海馬神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和p62表達(dá)的變化;通過免疫熒光染色觀察海馬神經(jīng)元自噬標(biāo)記物L(fēng)C3蛋白聚集的改變;通過透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元自噬泡的改變;為了進(jìn)一步探索自噬的作用，我們離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，使用自噬抑制劑Bafilomycin Al人為阻斷自噬后觀察凋亡的變化。
　　結(jié)果:
　　STZ誘導(dǎo)糖尿病模

8、型成功后，與Con組小鼠相比，DM組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出了明顯的代謝參數(shù)的改變:血糖明顯升高、體重顯著下降以及飲食量和飲水量明顯增加(P＜0.05);認(rèn)知功能的檢測結(jié)果提示DM組小鼠的運(yùn)動距離和游泳速度與Con組小鼠相比并沒有表現(xiàn)出明顯差異（P＞0.05），但是DM組小鼠的逃逸潛伏期明顯長于Con組小鼠，平臺跨越次數(shù)以及第三象限停留時間明顯少于Con組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;HE染色的結(jié)果表明，與Con組小鼠相比，DM

9、組小鼠表現(xiàn)出了明顯的神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變:結(jié)構(gòu)層次紊亂，神經(jīng)元排列稀疏、不規(guī)則，細(xì)胞周圍間隙增大，部分神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞體積縮小;細(xì)胞核固縮成三角形或不規(guī)則形狀，核仁淡染或消失;尼氏染色的結(jié)果指出DM組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度明顯低于Con組小鼠(P＜0.05);透射電鏡觀察到DM組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元明顯的超微結(jié)構(gòu)損害:突觸數(shù)目減少、突觸間隙增寬、突觸后致密物質(zhì)降低及突觸小泡減少等，線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，混濁腫脹，線粒體嵴中斷或消失

10、;Wcstern blot的結(jié)果提示，與Con組小鼠相比，DM組小鼠Synaptophysin和PSD95的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，Cleaved caspase-3和Bax表達(dá)明顯增加，Bcl-2表達(dá)顯著減少（P＜0.05）;與Con組小鼠相比，DM組小鼠的自噬水平顯著上調(diào)，主要表現(xiàn)為:自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ和自噬相關(guān)蛋白Beclin1的蛋白表達(dá)明顯增加，自噬底物蛋白p62的表達(dá)顯著降低，LC3+NeuN雙染陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，自

11、噬泡的形成明顯增加（P＜0.05）;而抑制自噬后，高糖處理引起的Cleaved caspase-3、Bax表達(dá)的增加和Bcl-2表達(dá)的降低這一趨勢明顯加?。≒＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　在體動物模型證實(shí)糖尿病引起了神經(jīng)元凋亡水平的增加，同時引起了海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞及神經(jīng)元密度的降低，破壞了突觸的超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了突觸結(jié)構(gòu)和功能的損傷，上述因素共同作用引起了小鼠認(rèn)知功能的下降。同時，在體實(shí)驗(yàn)表明糖尿病上調(diào)了海馬神經(jīng)元的

12、自噬水平，而離體原代神經(jīng)元培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)一步指出自噬在糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中起著保護(hù)作用。
　　第二部分利拉魯肽通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路上調(diào)自噬改善糖尿病引起的認(rèn)知功能下降
　　目的:
　　糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能下降作為糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，引起了人們的廣泛關(guān)注。然而，相應(yīng)的臨床干預(yù)和處理卻很少。利拉魯肽是一種胰高糖素樣多肽1(Glucagon-like pepti

13、de1，GLP-1)類似物，其可根據(jù)機(jī)體內(nèi)葡萄糖水平的高低，按需促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，從而有效調(diào)節(jié)血糖。近年來，越來越多的研究報道了利拉魯肽的胰外作用，其中神經(jīng)保護(hù)作用備受關(guān)注。在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們主要探索利拉魯肽能否改善糖尿病引起的神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能損害，同時結(jié)合第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步探索其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　健康SPF級6周齡雄性小鼠，隨機(jī)分為對照組(Con)、糖尿病組(DM)和DM+利拉魯肽組(DM+LR

14、G)，每組15只。STZ誘導(dǎo)糖尿病動物模型成功后，利拉魯肽處理8周。利拉魯肽對糖尿病引起認(rèn)知功能下降的作用研究:藥物處理期間定期監(jiān)測小鼠血糖、體重、飲食量和飲水量;8W后通過曠場實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測糖尿病動物認(rèn)知功能的變化;通過HE染色和尼氏染色觀察神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變;通過透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)的變化;通過Western blot檢測海馬Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的改變。利拉魯肽神經(jīng)保護(hù)作

15、用的機(jī)制研究:通過Western blot和Real-time RT-PCR檢測海馬神經(jīng)元自噬相關(guān)基因Atg12、Atg5、LC3、Beclin1和p62表達(dá)的變化;通過免疫熒光染色觀察海馬神經(jīng)元自噬標(biāo)記物L(fēng)C3蛋白聚集的改變;為了進(jìn)一步研究其相關(guān)機(jī)制，我們采用離體模型-海馬原代神經(jīng)元培養(yǎng)，使用AMPK特異性抑制劑Compound C阻斷相關(guān)信號通路后觀察自噬的變化。
　　結(jié)果:
　　糖尿病造模成功后，DM組小鼠表現(xiàn)出了高血

16、糖、低體重、多飲多食等典型的糖尿病代謝特點(diǎn)，而連續(xù)注射利拉魯肽后，與DM組小鼠相比，DM+LRG組小鼠并沒有表現(xiàn)出明顯的上述代謝指標(biāo)的改善（P＞0.05）;認(rèn)知功能檢測結(jié)果表明與DM組小鼠比較，DM+LRG組小鼠的逃逸潛伏期明顯降低，平臺穿越次數(shù)和第三象限停留時間顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);形態(tài)學(xué)的檢查結(jié)果顯示利拉魯肽處理明顯減輕了DM組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞和神經(jīng)元密度的降低，同時改善了突觸超微結(jié)構(gòu)的損傷

17、;Western blot結(jié)果表明與DM組小鼠比較，DM+LRG組小鼠的促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）;與Con組小鼠相比，DM組小鼠和DM+LRG組小鼠的自噬水平都有所上調(diào)，主要表現(xiàn)為:自噬相關(guān)基因Atg12、Atg5、LC3、Beclin1 mRNA水平的增加和p62 mRNA水平的下降、LC3、Beclin1蛋白表達(dá)的增加和p62蛋白表達(dá)的下降以及LC3+NeuN雙染陽性細(xì)胞數(shù)的增加（P

18、＜0.05），而與DM組小鼠比較，DM+LRG組小鼠的上述改變更加明顯（P＜0.05）;原代神經(jīng)元培養(yǎng)的結(jié)果提示，利拉魯肽處理進(jìn)一步上調(diào)了海馬原代神經(jīng)元的自噬水平，而使用AMPK抑制劑Compound C之后，部分逆轉(zhuǎn)了這種趨勢(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　利拉魯肽處理降低了糖尿病引起的海馬神經(jīng)元凋亡，改善了糖尿病引起的神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷和神經(jīng)元密度降低，減輕了突觸超微結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而改善了糖尿病引起的認(rèn)知功能下降。同