利拉魯肽對糖尿病小鼠認知功能下降的作用及其分子機制研究.pdf

1、糖尿病是一種以慢性高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征，常伴有多尿多飲多食等臨床表現，其發(fā)病率逐年上升，已成為一種嚴重影響人民健康的全球性公共衛(wèi)生問題。糖尿病的慢性并發(fā)癥遍及全身各大重要臟器，作為糖尿病一種嚴重但卻容易被忽略的并發(fā)癥，糖尿病相關認知功能下降已經逐漸引起人們的關注。但是，其潛在的發(fā)病機制及相應的臨床干預措施仍不清楚。
　　自噬在細胞的存亡中起著重要的作用，并且和很多神經退行性疾病相關。自噬是否參與了糖尿病相關認知功能下降

2、，目前仍不清楚。鑒于糖尿病相關認知功能損害對患者生活質量的嚴重影響，研究其潛在的發(fā)病機制，有助于我們更好的了解這種疾病，從而尋找更有效的治療措施和發(fā)現新的治療靶點。近年來越來越多的研究報道了利拉魯肽在各種實驗動物模型和臨床退行性疾病中的潛在神經保護作用。但是利拉魯肽對糖尿病相關認知功能下降的作用尚不十分明確。
　　本研究通過糖尿病動物在體模型和原代海馬神經元離體培養(yǎng)，研究了糖尿病相關認知功能損傷的發(fā)病機制及其干預措施。我們的研究發(fā)

3、現，糖尿病引起了海馬神經元的損傷和之后的認知功能下降，而自噬參與其中，并起著一定的保護作用。此外，我們發(fā)現利拉魯肽處理改善了糖尿病引起的神經元損傷和認知功能損害，同時，利拉魯肽通過AMPK/mTOR信號通路進一步上調了自噬水平。因此，我們推測利拉魯肽通過激活AMPK/mTOR信號通路上調自噬，從而改善糖尿病引起的認知功能下降。通過上述研究，我們揭示了利拉魯肽在糖尿病相關認知功能下降中潛在的神經保護作用及其部分相關機制。
　　本研究

4、分為兩個部分:
　　第一部分:自噬在糖尿病引起的神經元損傷和認知功能下降中的作用;
　　第二部分:利拉魯肽通過激活AMPK/mTOR信號通路上調自噬改善糖尿病引起的認知功能下降。
　　第一部分自噬在糖尿病引起的神經元損傷和認知功能下降中的作用
　　目的:
　　糖尿病是一種嚴重影響人民健康的全球性公共衛(wèi)生問題，并且其患病率在全球范圍內呈上升趨勢。作為糖尿病一種嚴重但卻容易被忽略的并發(fā)癥，糖尿病相關認知功能下降

5、已經逐漸引起人們的關注。但是，其潛在的發(fā)病機制仍不清楚。近年來越來越多的研究指出自噬在細胞的存亡中起著重要的作用，并且自噬和很多神經退行性疾病相關。在這部分研究中，我們通過離體和在體實驗旨在研究自噬在糖尿病引起的神經元損傷和認知功能損害中的作用。
　　方法:
　　健康SPF級6周齡雄性小鼠，隨機分為對照組(Con)和糖尿病組(DM)，每組15只。我們通過鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)一次性腹腔注射制備糖尿

6、病動物模型。糖尿病引起認知功能下降的研究:STZ誘導糖尿病模型成功后，定期監(jiān)測小鼠血糖、體重、飲食量和飲水量;8W后通過曠場實驗和Morris水迷宮實驗檢測糖尿病動物認知功能的變化;通過HE染色觀察神經元形態(tài)結構的改變;通過尼氏染色觀察神經元數目的變化;通過透射電鏡觀察海馬神經元突觸和線粒體超微結構的改變;通過Western blot檢測海馬突觸蛋白Synaptophysin和PSD95及凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3、

7、Bcl-2和Bax表達的改變。自噬在糖尿病誘導的神經元損傷中作用的研究:通過Western blot檢測海馬神經元自噬相關蛋白LC3、Beclin1和p62表達的變化;通過免疫熒光染色觀察海馬神經元自噬標記物LC3蛋白聚集的改變;通過透射電鏡觀察海馬神經元自噬泡的改變;為了進一步探索自噬的作用，我們離體培養(yǎng)海馬神經元，使用自噬抑制劑Bafilomycin Al人為阻斷自噬后觀察凋亡的變化。
　　結果:
　　STZ誘導糖尿病模

8、型成功后，與Con組小鼠相比，DM組小鼠在實驗過程中表現出了明顯的代謝參數的改變:血糖明顯升高、體重顯著下降以及飲食量和飲水量明顯增加(P＜0.05);認知功能的檢測結果提示DM組小鼠的運動距離和游泳速度與Con組小鼠相比并沒有表現出明顯差異（P＞0.05），但是DM組小鼠的逃逸潛伏期明顯長于Con組小鼠，平臺跨越次數以及第三象限停留時間明顯少于Con組小鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;HE染色的結果表明，與Con組小鼠相比，DM

9、組小鼠表現出了明顯的神經元形態(tài)結構的改變:結構層次紊亂，神經元排列稀疏、不規(guī)則，細胞周圍間隙增大，部分神經元變性壞死，細胞體積縮小;細胞核固縮成三角形或不規(guī)則形狀，核仁淡染或消失;尼氏染色的結果指出DM組小鼠海馬CA1區(qū)神經元密度明顯低于Con組小鼠(P＜0.05);透射電鏡觀察到DM組小鼠海馬CA1區(qū)神經元明顯的超微結構損害:突觸數目減少、突觸間隙增寬、突觸后致密物質降低及突觸小泡減少等，線粒體結構被破壞，混濁腫脹，線粒體嵴中斷或消失

10、;Wcstern blot的結果提示，與Con組小鼠相比，DM組小鼠Synaptophysin和PSD95的表達明顯降低(P＜0.05)，Cleaved caspase-3和Bax表達明顯增加，Bcl-2表達顯著減少（P＜0.05）;與Con組小鼠相比，DM組小鼠的自噬水平顯著上調，主要表現為:自噬標記物LC3-Ⅱ和自噬相關蛋白Beclin1的蛋白表達明顯增加，自噬底物蛋白p62的表達顯著降低，LC3+NeuN雙染陽性細胞數明顯增多，自

11、噬泡的形成明顯增加（P＜0.05）;而抑制自噬后，高糖處理引起的Cleaved caspase-3、Bax表達的增加和Bcl-2表達的降低這一趨勢明顯加劇（P＜0.05）。
　　結論:
　　在體動物模型證實糖尿病引起了神經元凋亡水平的增加，同時引起了海馬神經元形態(tài)結構的破壞及神經元密度的降低，破壞了突觸的超微結構，導致了突觸結構和功能的損傷，上述因素共同作用引起了小鼠認知功能的下降。同時，在體實驗表明糖尿病上調了海馬神經元的

12、自噬水平，而離體原代神經元培養(yǎng)結果進一步指出自噬在糖尿病誘導的神經元損傷中起著保護作用。
　　第二部分利拉魯肽通過激活AMPK/mTOR信號通路上調自噬改善糖尿病引起的認知功能下降
　　目的:
　　糖尿病相關認知功能下降作為糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，嚴重影響了患者的生活質量，增加了患者的經濟負擔，引起了人們的廣泛關注。然而，相應的臨床干預和處理卻很少。利拉魯肽是一種胰高糖素樣多肽1(Glucagon-like pepti

13、de1，GLP-1)類似物，其可根據機體內葡萄糖水平的高低，按需促進胰島β細胞分泌胰島素，從而有效調節(jié)血糖。近年來，越來越多的研究報道了利拉魯肽的胰外作用，其中神經保護作用備受關注。在這部分實驗中，我們主要探索利拉魯肽能否改善糖尿病引起的神經元損傷和認知功能損害，同時結合第一部分實驗結果，初步探索其相關機制。
　　方法:
　　健康SPF級6周齡雄性小鼠，隨機分為對照組(Con)、糖尿病組(DM)和DM+利拉魯肽組(DM+LR

14、G)，每組15只。STZ誘導糖尿病動物模型成功后，利拉魯肽處理8周。利拉魯肽對糖尿病引起認知功能下降的作用研究:藥物處理期間定期監(jiān)測小鼠血糖、體重、飲食量和飲水量;8W后通過曠場實驗和Morris水迷宮實驗檢測糖尿病動物認知功能的變化;通過HE染色和尼氏染色觀察神經元形態(tài)結構和數目的改變;通過透射電鏡觀察海馬神經元突觸超微結構的變化;通過Western blot檢測海馬Cleaved caspase-3蛋白表達的改變。利拉魯肽神經保護作

15、用的機制研究:通過Western blot和Real-time RT-PCR檢測海馬神經元自噬相關基因Atg12、Atg5、LC3、Beclin1和p62表達的變化;通過免疫熒光染色觀察海馬神經元自噬標記物LC3蛋白聚集的改變;為了進一步研究其相關機制，我們采用離體模型-海馬原代神經元培養(yǎng)，使用AMPK特異性抑制劑Compound C阻斷相關信號通路后觀察自噬的變化。
　　結果:
　　糖尿病造模成功后，DM組小鼠表現出了高血

16、糖、低體重、多飲多食等典型的糖尿病代謝特點，而連續(xù)注射利拉魯肽后，與DM組小鼠相比，DM+LRG組小鼠并沒有表現出明顯的上述代謝指標的改善（P＞0.05）;認知功能檢測結果表明與DM組小鼠比較，DM+LRG組小鼠的逃逸潛伏期明顯降低，平臺穿越次數和第三象限停留時間顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);形態(tài)學的檢查結果顯示利拉魯肽處理明顯減輕了DM組小鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)結構的破壞和神經元密度的降低，同時改善了突觸超微結構的損傷

17、;Western blot結果表明與DM組小鼠比較，DM+LRG組小鼠的促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表達明顯下降（P＜0.05）;與Con組小鼠相比，DM組小鼠和DM+LRG組小鼠的自噬水平都有所上調，主要表現為:自噬相關基因Atg12、Atg5、LC3、Beclin1 mRNA水平的增加和p62 mRNA水平的下降、LC3、Beclin1蛋白表達的增加和p62蛋白表達的下降以及LC3+NeuN雙染陽性細胞數的增加（P

18、＜0.05），而與DM組小鼠比較，DM+LRG組小鼠的上述改變更加明顯（P＜0.05）;原代神經元培養(yǎng)的結果提示，利拉魯肽處理進一步上調了海馬原代神經元的自噬水平，而使用AMPK抑制劑Compound C之后，部分逆轉了這種趨勢(P＜0.05)。
　　結論:
　　利拉魯肽處理降低了糖尿病引起的海馬神經元凋亡，改善了糖尿病引起的神經元形態(tài)結構損傷和神經元密度降低，減輕了突觸超微結構的破壞，進而改善了糖尿病引起的認知功能下降。同