核因子-κB在非對(duì)稱性二甲基精氨酸誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的:
　　 動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一類發(fā)生在動(dòng)脈血管壁的慢性進(jìn)行性炎癥反應(yīng)性疾病，是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是粥樣斑塊形成的三個(gè)最為關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是AS 發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥等是AS 致病性的危險(xiǎn)因素，血漿非對(duì)稱性二甲基

2、精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）與這些危險(xiǎn)因素密切相關(guān)，被認(rèn)為是一個(gè)新的心血管疾病的危險(xiǎn)因子。ADMA是內(nèi)皮源性一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。正常情況下人體血漿ADMA不足以抑制NOS 活性，但在機(jī)體應(yīng)激損傷時(shí)，血漿ADMA濃度則會(huì)明顯升高。高濃度的ADMA 可抑制NO 合成、損傷血管內(nèi)皮、促進(jìn)VSMCs 增生，但在巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞中的作用

3、研究相對(duì)較少，其具體機(jī)制尚不明確。NOS是NO 生物合成的關(guān)鍵限速酶，分為兩類：持續(xù)表達(dá)型（constitutive nitric oxide synthase，Cnos）和誘導(dǎo)型（inducible nitric oxide synthase，Inos）。Cnos 廣泛存在于正常的組織細(xì)胞中，Inos在正常情況下低表達(dá)甚或不表達(dá)，但在受到各種刺激時(shí)可誘導(dǎo)表達(dá)。血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1（lectin like oxidized l

4、ow density lipoprotein receptor-1，LOX-1）是氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）的特異受體，在結(jié)構(gòu)上與巨噬細(xì)胞經(jīng)典的清道夫受體不具有同源性，屬于E 型清道夫受體。巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體無(wú)負(fù)反饋性地吞噬大量氧化低密度脂蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，形成泡沫細(xì)胞。研究表明，ADMA 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞LOX-1表達(dá)，但具體機(jī)制尚不清楚。Inos和LOX

5、-1的基因啟動(dòng)子區(qū)都含有核因子-κ B （nuclear factor kappa B，NF-κ B）結(jié)合位點(diǎn)，能夠與核蛋白特異結(jié)合調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄。NF-κ B是一種具有基因轉(zhuǎn)錄多項(xiàng)調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種細(xì)胞中。本研究擬采用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，分別在細(xì)胞水平和組織水平上探討在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，ADMA 影響Inos、LOX-1表達(dá)的機(jī)制，是否是通過(guò)激活NF-κ B 實(shí)現(xiàn)的。
　　 方法:
　　 1.體

6、外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)健康雄性Wistar大鼠50只。分離培養(yǎng)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組及處理：①正常對(duì)照組：以含10％ FBS DMEM 培養(yǎng)液與巨噬細(xì)胞共孵育；②oxLDL組：在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中加入oxLDL （終濃度50mg/L）；③A+O組：在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中先加入ADMA （終濃度15 μmol/L）共孵育2h后，再加入oxLDL （終濃度50mg/L）；④P+A+O組：在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中先加入PDTC （終濃度25 μmol/L）共孵

7、育30min后，再加入ADMA （終濃度15 μmol/L）共孵育2h，最后加入oxLDL （終濃度50mg/L）。②③④
　　 組細(xì)胞在加入oxLDL后，再繼續(xù)孵育48h。然后分別收集各組細(xì)胞和培養(yǎng)液，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量及培養(yǎng)液NO水平和Inos 活性，分別提取細(xì)胞總RNA、總蛋白及核蛋白。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Wes t en bl ot分別檢測(cè)Inos、LOX-1的Mrna和蛋白表達(dá)，以Actin為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)化；以凝膠電

8、泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測(cè)各組NF-κ B 活性。每組重復(fù)3次。
　　 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
　　 健康雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為四組：①正常對(duì)照組（n=10）：標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。②H組（n=12）：高脂飼料喂養(yǎng)。③A+H組（n=14）：高脂飼料喂養(yǎng)，給予ADMA[0.2mg/(kg·d)] 灌胃，每日一次。④P+A+H組（n=14）：高脂飼料喂養(yǎng)，給予ADMA[0.2mg/(kg·d)]

9、 灌胃，每日一次；PDTC [40mg/(kg·d)] 腹腔注射，每日一次。正常對(duì)照組、H組均給予等體積的生理鹽水灌胃和腹腔注射，A+H組給予等體積的生理鹽水腹腔注射。飼養(yǎng)滿18周后麻醉大鼠，采血檢測(cè)大鼠血清NO及Inos 活性；取胸主動(dòng)脈做病理切片，觀察其病理變化。分別以實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westen blot 檢測(cè)Inos、LOX-1的Mrna和蛋白表達(dá)，以Actin為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)化；以凝膠電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)

10、光法（ECL）檢測(cè)各組NF-κ B 活性。每組重復(fù)3次。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　　 ①oxLDL組和A+O組巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量較正常對(duì)照組明顯增加（均為P<0.05），且A+O 較oxLDL組升高更明顯（P<0.05），而P+A+O組膽固醇含量較A+O組降低（P<0.05）。②與正常對(duì)照組和oxLDL組相比，A+O組NO 含量降低（P<0.05或P<0.01）；P+A+O組NO 含量較A+

11、O組顯著升高（P<0.05）。③與正常對(duì)照組和oxLDL組相比，A+O組Inos 活力明顯升高（均為P<0.05），P+A+O組Inos 活力較A+O組明顯降低（P<0.05）。相關(guān)分析顯示：NO 含量和Inos 活力呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.773,P<0.05）④與正常對(duì)照組和oxLDL組相比，A+O組Inos Mrna和蛋白表達(dá)量顯著增加，其差異均有顯著性（分別為P<0.01和P<0.05）；P+A+O組Inos Mrna和蛋白表達(dá)

12、較A+O組明顯降低（P<0.05）。⑤A+O組LOX-1Mrna和蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組和oxLDL組增強(qiáng)，其差異均有顯著性（均為P<0.05）；與A+O組相比，P+A+O組LOX-1Mrna和蛋白表達(dá)明顯降低，兩組差異有顯著性（P<0.05）。⑥A+O組NF-κ B活性較正常對(duì)照組和oxLDL組明顯增強(qiáng)，其差異均有顯著性（均為P<0.05）；與A+O組相比，P+A+O組NF-κ B 活性明顯降低，兩組差異有顯著性（P<0.05）。⑦相關(guān)

13、分析：
　　 NF-κ B 活性與Inos Mrna和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r分別為0.82、0.81）；
　　 NF-κ B 活性與LOX-1Mrna和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r 均為0.82）。
　　 2.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　 ①主動(dòng)脈病理切片HE 染色顯示：正常對(duì)照組血管內(nèi)膜光滑、完整，未見(jiàn)空泡形成；H組血管內(nèi)膜毛糙、但尚完整、有少量空泡形成；A+H組血管內(nèi)膜斷裂，血管中層SMCs 增生明

14、顯，且排列紊亂，內(nèi)膜層與中膜層有大量空泡形成；P+A+H組血管內(nèi)膜完整，SMCs 增生程度較A+H組明顯減輕，空泡數(shù)量也較A+H組明顯減少。②
　　 與對(duì)照組和H組比較，A+H組大鼠血清NO水平和Inos 活性明顯升高，差異均有顯著性（均為P<0.05），P+A+H組NO水平和Inos 活性較A+H組明顯降低（均為P<0.05）。相關(guān)分析顯示，NO水平和Inos 活性呈正相關(guān)（r=0.68,P<0.05）。③與對(duì)照組和H組相比，

15、A+H組大鼠主動(dòng)脈Inos Mrna和蛋白表達(dá)量顯著增加，（分別為P<0.01和P<0.05），P+A+H組Inos Mrna和蛋白表達(dá)量較A+H組明顯降低，兩組相比差異有顯著性（P<0.05）。④與對(duì)照組和H組相比，A+H組大鼠主動(dòng)脈LOX-1Mrna和蛋白表達(dá)量顯著增加，（均為P<0.05），P+A+H組LOX-1Mrna和蛋白表達(dá)量較A+H組明顯降低，兩組相比差異有顯著性（P<0.05）。⑤A+H組NF-κ B 活性較正常對(duì)照組和

16、H組明顯增強(qiáng)，其差異均有顯著性（均為P<0.05）；與A+H組相比，P+A+H組NF-κ B活性明顯降低，兩組差異有顯著性（P<0.05）。⑥相關(guān)分析：NF-κ B 活性與iNOSmRNA和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r分別為0.85、0.87）；NF-κ B 活性與LOX-1mRNA和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r分別為0.79、0.81）。
　　 結(jié)論:
　　 ADMA能夠通過(guò)激活NF-κ B上調(diào)Inos和LOX-1