胞漿小滴與精子運動相關性及參與精子能量代謝機制研究.pdf

1、目的：
　　精子的運動功能或運動能力的強弱直接關系到人類的生殖能力。只有正常作前向運動的精子才能確保精子抵達輸卵管壺腹部與卵子結合形成受精卵。據(jù)國內文獻報道，因精子活力低下而導致的男性不育約占30％。胞漿小滴(Cytoplasmdroplets，CD)是生殖細胞大部分被支持細胞所吞噬后細胞質的殘存體，留存于精子頸/體部。作為精子的附屬結構，臨床醫(yī)生認為精子CD的殘留是導致精子活力低下的重要原因之一，將CD的存在與不育癥聯(lián)系在一起;

2、而基礎科學家認為CD是有正常功能的精子正常的結構特點。CD的功能及其作用機理至今仍然不清楚。
　　在絕大多數(shù)哺乳動物物種中，精子成熟的典型特征之一是附睪精子的CD結構從精子中段近端移動到遠端，CD被保存在大多數(shù)哺乳動物附睪尾部精子中。近期科學家們關于CD的相關研究已經(jīng)有一些有價值的發(fā)現(xiàn)，認為CD在調節(jié)精子滲透壓方面起到了重要的作用;在CD中發(fā)現(xiàn)兩種標志性物質-泛素和15-脂氧化酶;CD中含有的P450芳香化酶與雄激素產(chǎn)生有關，參與

3、了附睪內精子成熟的調節(jié)等。
　　在精子從附睪頭部相對靜止的狀態(tài)到射精后精子的超激活運動，CD經(jīng)歷了從精子中段近端移動到遠端，最后被完全脫去的過程。但是，除了CD能夠調節(jié)滲透壓之外，CD中究竟包含何種成份、CD通過何種分子途徑影響精子的運動能力的還需要進一步研究，目前尚無相關報導。因此，在本研究中，我們通過實驗將明確CD在精子不同成熟時期及射精后與精子運動的關系，同時深入研究CD的形態(tài)及蛋白組學構成，從而分析精子從睪丸釋放至射精后這

4、一時間段內CD與精子的成熟有何相關性和作用機制，從不同角度闡述CD與精子運動能力的關系，為男性不育的機理及臨床診斷與治療提供了新的思路。
　　材料與方法：
　　一、實驗材料
　　1、不同品種（系）(C57BL/6J，F(xiàn)VB，ICR)小鼠選購于中國醫(yī)科大學實驗動物部，為健康雄性及雌性，周齡8-16周。
　　2、電鏡檢測相關試劑
　　3、免疫熒光檢測相關試劑
　　4、Western Blot相關試劑

5、>　　5、蛋白質譜分析相關試劑
　　二、實驗方法
　?。ㄒ唬┬∈蟾讲G精子計數(shù)
　　1、計數(shù)不同品種（系）小鼠附睪精子在附睪各部位（頭，體，尾）處有CD和無CD結構的精子數(shù)量，并分類計數(shù)游動精子與不游動精子數(shù)量，進行統(tǒng)計學分析。
　　2、根據(jù)CD在精子的不同位置（頭/頸部、中段、尾部）分類計數(shù)不同品種（系）(C57BL/6J，F(xiàn)VB，ICR)小鼠的附睪精子，進行統(tǒng)計學分析。
　?。ǘ┬∈笊渚蟠剖笊车谰?/p>

6、計數(shù)
　　雌雄鼠交配后，計數(shù)雌鼠的子宮及陰道內精子有CD及無CD精子數(shù)量。
　?。ㄈ┌麧{小滴的提取
　　切取小鼠的附睪，獲取精子懸液。應用非連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法提取CD的游離體。
　?。ㄋ模┟庖邿晒鈾z測CD純度
　　CD沉淀加入少量PBS溶液混勻，取出一滴涂片后風干。無水乙醇固定3-5分鐘，風干。用4％多聚甲醛固定并在4℃含0.5％ Triton X-100 PBS緩沖液中
　　放置2分鐘。一抗

7、（兔抗鼠SPEM1和UBlQUITIN）室溫下加入熒光素標記的二抗孵育1小時，用1×PBS沖洗3次，熒光顯微鏡下觀察CD的純度。
　?。ㄎ澹╇婄R樣本制作
　　將CD提取物離心2次，吸取沉淀物，加入3％-4％戊二醛2ml固定30min，用0.2mol/L磷酸緩沖液離心洗滌3次，沉淀物中加入1％鋨酸處理后，離心沉淀分成2份，一份用1％瓊脂包埋，經(jīng)50％～100％濃度梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷滲透，過夜。Epon812包埋、切片、醋酸

8、鈾和枸櫞鉛染色、透射電鏡下觀察并拍照。另一份用50％、70％、90％和100％乙醇做梯度脫水，每次15分鐘，離心3000r/min，5分鐘。臨界點干燥后離子濺射儀噴金，時間80秒、電流15mA、真空7-10Pa，用于掃描電鏡觀察并拍照。
　?。?Western Blot免疫印跡檢測
　　使用裂解液分別取各組精子的蛋白質，然后SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉印、脫脂奶粉中封閉過夜、一抗（LDHC和PGK2）孵育、辣根過氧化物

9、酶標記的二抗孵育以及ECL發(fā)光，成像后進行圖像分析。
　?。ㄆ撸┌麧{小滴蛋白質譜分析
　　SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白總的精子蛋白、CD蛋白及剩余精子蛋白，使用考馬斯亮蘭染色方法找出CD組中的差異蛋白條帶。切取差異蛋白條帶后，經(jīng)過還原以及使用乙腈進行乙酰胺基化處理后，使用ABI4700 MALDI TOF/TOF分析儀分析并收集蛋白數(shù)據(jù)。
　?。ò耍┙y(tǒng)計方法
　　所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件（18.0版）進行統(tǒng)計

10、分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　一、胞漿小滴與附睪精子運動的相關性
　　不同品系小鼠附睪頭部游動的精子數(shù)量明顯少于不游動精子數(shù)量。精子運動在附睪體部明顯加強，尾部精子運動能力最強。精子游動組與不游動組有CD精子所占的比例有顯著差異(p＜0.01)。說明在附睪精子中CD與精子的運動有相關性。
　　二、胞漿小滴在精子上不同位置與精子運動的相關性
　　不同品種（系）小鼠附睪頭、體部及尾部

11、游動組精子中，CD在精子不同位置所占比例有顯著不同。當CD位于精子中部時，與其他部位相比較有顯著差異(p＜0.01)。說明CD位于精子中部時與精子的運動有相關性。
　　三、交配后雌鼠生殖道內精子胞漿小滴被脫去
　　精子射精后進入雌鼠生殖道內，幾乎只有很少數(shù)量的精子還有CD留存，絕大多數(shù)精子的CD結構消失。說明正常的精子射精后CD被脫去。
　　四、胞漿小滴純化
　　通過非連續(xù)蔗糖密度梯度離心法可以提取得到高純度的C

12、D。鏡檢未見殘存精子?？捎糜谶M一步實驗。
　　五、掃描電鏡下胞漿小滴形態(tài)
　　掃描電鏡下CD的形狀幾乎與光鏡下觀察到的CD完全相同。呈球形或雙丸狀，外表不光滑，可見多個膜樣的小泡，大小不均勻。直徑大約為2μm。六、透射電鏡下胞漿小滴形態(tài)
　　透射電鏡下觀察CD直徑大約為2.3μm，內可見膜樣結構，不同CD細胞基質的密度有較大差別。部分CD含有中度電子致密物。但有一些CD的基質密度明顯減低，有可能是內容物在脫離精子時丟失

13、。CD的外膜看起來是連續(xù)性的，看不到脫離精子時膜的破裂。
　　七、Western Blot結果
　　為了證實LDHC和PGK2確實存在于CD中，而且CD中的含量高于精子膜，我們用Western Blot法檢測全精子、游離的CD和脫去CD后剩余精子的蛋白質水平。結果顯示LDHC在游離的CD和全精子組中含量較高，而PGK2則僅在游離的CD中含量較高。
　　八、蛋白質譜分析結果
　　質譜分析檢測出純化的CD中有105種

14、蛋白，這些蛋白可以被分為8類。其中細胞骨架蛋白約占8％、轉運蛋白約占1％、糖蛋白約占1％、熱休克蛋白約占1％、脂蛋白約占3％、核蛋白質約占2％，其它稀有蛋白質約占9％，而這些蛋白質中約68％是酶。
　　結論：
　　1、當精子在附睪成熟過程中，位于精子中段CD的存在是精子成熟過程中的正常結構;CD在射精后應從精子上正常脫落。
　　2、CD的存在與精子的運動能力有相關性，CD存在的位置對精子運動有顯著影響，當CD位于精子中