XRCC1、XPD和TERT基因與無(wú)精子癥的相關(guān)性研究及機(jī)制探討.pdf

1、據(jù)WHO估計(jì)，全球約10-15％的育齡夫婦不孕不育，據(jù)此推算，世界上不孕不育的總?cè)藬?shù)已超過(guò)8千萬(wàn)，其中約50％的原因在男方。而男性不育中又有半數(shù)病例表現(xiàn)為原因未明的原發(fā)性無(wú)精子癥，主要是由遺傳因素造成的。 精子發(fā)生是一個(gè)連續(xù)的細(xì)胞分裂分化過(guò)程，包括精原細(xì)胞分裂增殖、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子細(xì)胞變態(tài)三個(gè)主要階段，最終產(chǎn)生成熟的精子。所有這些高度有序的過(guò)程均需要相關(guān)基因進(jìn)行精確地調(diào)節(jié)，而這些重要基因的缺失或者功能異常都會(huì)導(dǎo)致無(wú)精子癥。

2、 本研究從分子流行病學(xué)角度和分子生物學(xué)層面，分別探討了精子發(fā)生過(guò)程中的3個(gè)重要基因，xRCC1、XPD和TERT基因，與無(wú)精子癥的相關(guān)性及其可能的機(jī)制。這對(duì)于揭示男性生殖的分子調(diào)控機(jī)制及臨床男性不育癥的診治具有一定的理論和實(shí)踐意義。 第一部分：XRCC1和XPD基因多態(tài)性與原發(fā)性無(wú)精子癥易感性關(guān)系的分子流行病學(xué)研究 XRCC1是堿基切除修復(fù)系統(tǒng)(base excision repair,BER)的重要成員，而XP

3、D是核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)(nucleotide excision repair,NER)的重要成員，它們?cè)诰S持基因組穩(wěn)定性過(guò)程中起關(guān)鍵作用。大量研究報(bào)道，DNA修復(fù)基因的多態(tài)性會(huì)影響不同個(gè)體的DNA修復(fù)能力，從而導(dǎo)致其罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)不同。但迄今為止，DNA修復(fù)基因的多態(tài)性在男性不育中的作用卻鮮有報(bào)道。 本研究采用候選基因關(guān)聯(lián)研究(candidate gene-based associationstudy)方法，探討了XRCC1和X

4、PD基因單核苷酸多態(tài)與中國(guó)漢族人群男性不育遺傳易感性的關(guān)系，研究對(duì)象包括171例原發(fā)性無(wú)精子癥患者和247例生育正常男性，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性酶切片段多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對(duì)XRCC1基因多態(tài)Arg194Trp、Arg399Gln和XPD基因多態(tài)Lys751Gln進(jìn)行基因分型。以非條件Logistc回歸模型分析基因多態(tài)與原發(fā)性無(wú)精子癥的相關(guān)性，并用SAS分析基因-基因的交互作用。結(jié)果顯示：本研究的三個(gè)基因多態(tài)均符合Hardy

5、-Weinberg平衡；XPD 751 Gln等位基因的頻率在無(wú)精子癥病例組(11.40％)要顯著高于對(duì)照組(5.67％)，(p=0.004)；XPD 751Lys/Gln+Gln/Gln變異基因型攜帶者罹患無(wú)精子癥的風(fēng)險(xiǎn)高于野生基因型Lys/Lys(OR=2.09，95％CI=1.22-3.57)；聯(lián)合分析顯示，同時(shí)攜帶XRCC1194 Arg/Arg和XPD 751 Lys/Gln+Gln/Gln基因型者，罹患無(wú)精子癥的風(fēng)險(xiǎn)增加了4

6、.1倍(OR=5.100，95％CI=1.951-13.330)，同時(shí)攜帶XRCC1 399 Arg/Arg和XPD 751 Lys/Gln+Gln/Gln基因型者，罹患無(wú)精子癥的風(fēng)險(xiǎn)也顯著增加(OR=3.064，95％CI=1.440-6.523)。 上述結(jié)果顯示，XPD Lys751 Gln基因多態(tài)可能是我國(guó)漢族人群原發(fā)性無(wú)精子癥的遺傳易感因素，有必要加大樣本量證實(shí)本研究的結(jié)果。 第二部分：TERT基因與無(wú)精子癥的相

7、關(guān)性研究及其機(jī)制探討 端粒位于真核細(xì)胞染色體末端，由串聯(lián)排列的DNA重復(fù)序列和端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成，其作用為保護(hù)染色體末端并維護(hù)基因組穩(wěn)定。端粒隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而不斷縮短，當(dāng)縮短到臨界長(zhǎng)度時(shí)就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白復(fù)合體，能以其自身RNA(TR)為模板反轉(zhuǎn)錄合成端粒重復(fù)序列，并將其加到染色體末端，從而恢復(fù)端粒長(zhǎng)度，使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖能力。約90％以上的惡性腫瘤細(xì)胞都含有端粒酶活性，而在正常組織，僅有生

8、殖細(xì)胞及造血干細(xì)胞系等可檢測(cè)到端粒酶活性。端粒酶催化亞基一端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(TERT)是端粒酶活性的限制組分，在原發(fā)性腫瘤、癌細(xì)胞系和永生化細(xì)胞系中，TERT基因的表達(dá)水平與端粒酶的活性一致，并與端粒酶的活化過(guò)程密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究顯示：端粒長(zhǎng)度、端粒酶活性及TERT基因的表達(dá)在精子發(fā)生過(guò)程中呈現(xiàn)特殊的時(shí)空性，但它們?cè)谀行陨成砗筒±碇械拇_切作用仍未闡明。 為了探討端粒酶及其催化亞基TERT在男性生殖病理中的作用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)

9、用端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增方法(TRAP)、定量PCR法和原位雜交法分別檢測(cè)了小鼠睪丸和不同病理類(lèi)型的無(wú)精子癥患者睪丸活檢標(biāo)本中端粒酶的活性(TA)以及端粒酶催化亞基TERT的表達(dá)。并在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用RNA干涉技術(shù)，對(duì)靶向TERT的RNA干涉后的小鼠精母細(xì)胞的生理改變進(jìn)行研究，主要研究結(jié)果如下： 1．實(shí)驗(yàn)中，TERT基因的表達(dá)水平與端粒酶的活性高度一致。在不同病理類(lèi)型的無(wú)精子癥睪丸標(biāo)本中，TERT基因的表達(dá)水平有顯著差異：唯支持細(xì)胞綜

10、合癥(SCOS)病例中檢測(cè)不出TA和TERT的表達(dá)；在生精正常的梗阻性無(wú)精子癥(OA)中，TA和TERT的表達(dá)較高；而在成熟障礙所致的生精阻滯(MA)病例中，TA和hTERT的表達(dá)不同程度降低。無(wú)精子癥患者精曲小管的hTERT原位雜交結(jié)果也顯示，hTERT基因分布于除精子外的各級(jí)生精細(xì)胞，而非睪丸支持細(xì)胞。因此，hTERT表達(dá)水平可以反映睪丸生精細(xì)胞的狀態(tài)，也可作為診斷不同病理類(lèi)型的無(wú)精子癥的輔助指標(biāo)。 2．核酸序列比對(duì)顯示，小