三氧化二砷誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、目的: 通過(guò)觀察三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的促凋亡作用，初步探討As2O3誘導(dǎo)VSMCs凋亡的機(jī)制，為其以后作為藥物涂層支架的涂層藥物提供理論依據(jù)。 方法: 無(wú)菌條件下取SD大鼠胸主動(dòng)脈血管中膜，運(yùn)用改良的植塊貼壁法體外培養(yǎng)VSMCs，在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行SMα-actin免疫組化

2、鑒定。繼續(xù)培養(yǎng)并傳代細(xì)胞，取第5～6代細(xì)胞，加入含濃度分別為0、1.0、4.0、8.0μmol/L As2O3的培養(yǎng)基(DMEM)共同孵育24h，分別采用四氮唑藍(lán)(MTT)還原反應(yīng)檢測(cè)As2O3對(duì)VSMCs活力的影響，采用流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測(cè)細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)外翻的細(xì)胞百分率、DAPI染色熒光顯微鏡觀察.As2O3作用后凋亡細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)等方法鑒定細(xì)胞凋亡，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)Caspase-3活性

3、，Rhodamine 123(Rh123)/碘化丙啶(PI)雙染色分析線粒體跨膜電位(mitochondrial membrane potential，△ψm)變化。 結(jié)果: ①培養(yǎng)的VSMCs生長(zhǎng)良好，光鏡下呈長(zhǎng)梭形及“峰與谷”樣生長(zhǎng)。SMα-actin免疫組化的結(jié)果顯示所得的細(xì)胞為典型的VSMCs；②As2O3對(duì)VSMCs具有促凋亡作用，該作用呈劑量及時(shí)間的依賴性，As2O3(1.0～8.0μmol/L)組在24h與同期對(duì)照

4、組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；③酶標(biāo)儀檢測(cè)表明：As2O3(1.0～8.0μmol/L)組在24h與同期對(duì)照組相比，VSMCs裂解液中Caspse-3酶活性明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；④Rh123/PI雙染色檢測(cè)表明：As2O3(1.0～8.0μmol/L)組在24h與同期對(duì)照組相比，VSMCs的△ψm明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論: ①改良植塊貼壁法能使VSMCs原代培養(yǎng)的時(shí)間明顯