雷帕霉素聯(lián)合供體未成熟樹突狀細胞誘導大鼠肝移植免疫耐受.pdf

1、器官移植已成為挽救終末期器官功能衰竭病人生命的有效途徑。外科技術和免疫抑制治療的進步已經(jīng)很大地改善了器官移植病人的短期存活率。然而，目前的免疫抑制劑有多種副作用，而如何改善移植病人的長期生存率和生活質量已成為當前器官移植領域的重要課題。解決這些問題的最終途徑就是誘導免疫耐受。 樹突狀細胞(dendriticcells，DC)作為機體惟一能激活初始型T細胞(naiveTcells)的專職抗原提呈細胞(antigen—present

2、ingcells，APC)，在誘導免疫應答和免疫耐受中都起重要作用。目前，對DC免疫學功能的研究已取得了較大進展：①未成熟DC(immatureDC，iDC)和成熟DC(matureDC，mDC)都能夠擁有致耐受特性。②DC的致耐受特性都與調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcells，Treg)有關。DC誘導免疫耐受的機制包括誘導T細胞無能、刪除反應性T細胞，或促進Treg增殖。最近的研究更支持Treg的作用。Treg被認為在致耐受D

3、C細胞下游信號轉導中起關鍵作用。③DC俘獲和交叉提呈外源性抗原的獨特功能在無炎癥環(huán)境下能誘導抗原特異性免疫耐受。 雷帕霉素(Rapamycin，RAPA，又名sirolimus)作為一種大環(huán)內(nèi)酯類的新型免疫抑制劑，已被廣泛應用于臨床抗排斥治療。研究表明，RAPA不僅能影響T淋巴細胞和B淋巴細胞的功能，也能直接抑制DC發(fā)育成熟和誘導DC凋亡，RAPA還能增加體內(nèi)Treg來誘導免疫耐受。 本文通過體外培養(yǎng)大鼠髓源性DC，分析

4、了雷帕霉素對未成熟DC和已成熟DC表型和細胞存活影響的差異，觀察雷帕霉素處理后不同成熟狀態(tài)DC分泌細胞因子水平及介導同種混合淋巴細胞增殖反應的變化。建立大鼠同種異體原位肝移植模型，通過供體髓源性未成熟DC回輸受體大鼠聯(lián)合術后短期應用雷帕霉素，觀察受體大鼠的生存時間，以及外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的增殖情況，探討雷帕霉素聯(lián)合未成熟DC誘導移植免疫耐受的可能機制。 第一部分雷帕霉素對大鼠髓源性樹突狀細胞表

5、型和功能的影響 DC在成熟過程中表型特征和功能均發(fā)生很大變化。未成熟DC顯示出較強的致耐受特性，但成熟DC在某些環(huán)境下也具有免疫調(diào)節(jié)能力。有研究表明，雷帕霉素能直接抑制DC抗原提呈功能、細胞遷移和發(fā)育成熟并誘導DC凋亡。為了進一步明確RAPA對DC功能的影響及其機制，我們研究了RAPA處理不同成熟狀態(tài)大鼠髓源性DC的細胞表型變化、凋亡情況、細胞因子分泌以及刺激同種異基因T淋巴細胞增殖能力的變化，并從分子生物學角度初步探討了RAP

6、A對維持DC自身生存和發(fā)揮免疫學功能的細胞信號轉導通路的影響。 我們使用重組大鼠粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(rrGM—CSF，終濃度為20ng/ml)和重組大鼠白細胞介素—4(rrIL—4，終濃度為10ng/ml)成功地體外培養(yǎng)出大鼠髓源性DC，大鼠DC特異性細胞表面標志物OX62陽性細胞數(shù)大于85％。在培養(yǎng)第6d加入脂多糖(LPS)的同時加入RAPA(1～100ng/ml)，2d后流式細胞儀(FACS)檢測結果顯示OX6(M

7、HCⅡ類分子)和共刺激分子CD40和CD86的上調(diào)顯著受抑，細胞凋亡增加。 因成熟DC在特殊環(huán)境下也可擁有致耐受特性，我們研究了RAPA對LPS刺激48h后成熟DC的影響。發(fā)現(xiàn)RAPA對已完全成熟的DC表型影響較小，已成熟的DC能抵抗臨床相關劑量RAPA(1～20ng/ml)的促凋亡作用。凝膠遷移率實驗(EMSA)結果顯示，LPS刺激后的成熟DC細胞核內(nèi)NF—κB被強烈激活，RAPA不改變已成熟DC中NF—κB的DNA結合能力。

8、因此，成熟DC對RAPA誘導凋亡的抵抗作用可能與NF—κB的活化有關。 我們進一步研究了RAPA對DC分泌細胞因子的影響。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結果顯示iDC在LPS作用下，IL-10和IL-12的分泌顯著增加。但同時加入RAPA后，IL-10和IL-12的分泌水平均降低。而且和其低的細胞因子水平相一致，混合淋巴細胞反應(MLR)中，這種RAPA處理后的iDC激活同種異基因T細胞的能力降低。第8d的mDC加入RAPA培養(yǎng)

9、24h以后，IL-10和TNF—α分泌減少，但IL-12卻不再受抑制。Real—timePCR結果顯示，IL-12p35mRNA水平?jīng)]有變化，但IL-12p40mRNA的表達稍有上升。RAPA處理后的mDC具有不同的細胞因子表達水平說明了這種成熟DC細胞內(nèi)信號轉導通路發(fā)生了改變。這種IL-12/IL-10的平衡向IL-12傾斜可能促進Th1反應并激發(fā)免疫應答，但我們的研究發(fā)現(xiàn)這種RAPA處理后的成熟DC同樣具有低的刺激同種異基因T細胞增

10、殖的能力。MLR中T淋巴細胞分泌Th1型細胞因子IFN—γ和Th2型細胞因子IL—4均降低。RAPA處理的DC抑制效應性T細胞增殖的同時，允許Treg細胞的活化和增殖可能解釋其抑制性的同種異基因T細胞增殖作用。通過調(diào)節(jié)DC功能來誘導或維持免疫耐受作用在某些環(huán)境下要求受者體內(nèi)DC的成熟和存活，同種異基因T細胞對RAPA處理后的成熟DC的低反應性可能為移植免疫耐受的誘導提供新的思路。 第二部分大鼠同種異體原位肝移植模型的建立與改進

11、 大鼠肝移植模型是進行移植免疫學研究的理想動物模型。我們在“二袖套法”的基礎對大鼠肝移植模型進行了改良。以近交系雄性Lewis(LEW)大鼠和雄性BrownNorway(BN)大鼠為供受體，實驗動物隨機分為3組：①對照組(n=12)：正常LEW大鼠為實驗對照；②同基因組(n=12)：LEW→LEW大鼠；③急性排斥組(n=12)：LEW→BN大鼠。肝上下腔靜脈后壁的吻合采用供體腔靜脈壁與受體膈肌環(huán)吻合，前壁采用腔靜脈壁對腔靜脈壁吻合

12、。各組術后14d和28d分別處死3只，觀察術后大鼠肝功能、移植肝組織病理學變化。每組留6只觀察生存時間。結果顯示，手術成功率大于85％。急性排斥組術后出現(xiàn)ALT和BIL急劇上升，Banff評分Ⅲ級，大鼠中位存活時間為32d。而同基因組ALT和BIL經(jīng)術后短期上升后14d時即出現(xiàn)下降，Banff評分0～1級，大鼠能長期存活。說明改良“二袖套法”LEW→BN大鼠肝移植模型是穩(wěn)定的急性排斥反應模型，可用于研究肝移植排斥反應和免疫耐受。

13、 第三部分雷帕霉素聯(lián)合未成熟樹突狀細胞促進CD4+CD25+Foxp3+T細胞增殖并誘導大鼠肝移植免疫耐受 CD4+CD25+Treg在對自身抗原和移植物的免疫耐受中發(fā)揮重要作用。體外實驗表明雷帕霉素能促進小鼠和人Treg增殖。RAPA處理的負載供者抗原的受體源性DC聯(lián)合短期應用RAPA能使小鼠心臟移植物長期存活。但RAPA聯(lián)合iDC是否能提高體內(nèi)Treg水平尚未闡明。我們研究了供者源性iDC聯(lián)合移植術后短期使用RAPA后受體大

14、鼠外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平以及是否能誘導大鼠肝移植免疫耐受。 首先，我們研究了RAPA聯(lián)合iDC誘導同種異基因大鼠產(chǎn)生Treg的情況。FACS結果顯示，正常大鼠外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞的比例在6％～8％之間，與文獻報道一致。單用RAPA腹腔注射7天或一次性靜脈注射2×106數(shù)量的iDC并不增加CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+T細胞中的比例

15、。而聯(lián)合使用RAPA和iDC后，CD4+CD25+Foxp3+Treg在外周血和脾臟CD4+T細胞中的比例增加(分別為9.31±0.54％和9.38±0.89％)。CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+CD25+T細胞的比例也增加。 由于聯(lián)合使用供者源性未成熟DC和移植后短期應用RAPA對受體T細胞增殖的影響以及這種方案是否能誘導免疫耐受均未被闡明，我們建立了Lewis→BN大鼠肝移植模型。大鼠分四組：①急性排斥組(n＝

16、12)：術后連續(xù)7天腹腔注射生理鹽水1ml；②RAPA組(n=12)：術后連續(xù)7天腹腔注射RAPA1mg/kg/day(day0～day6)；③未成熟DC組(iDC，n＝12)：術前3天(day—3)單次尾靜脈注射LEW大鼠髓源性培養(yǎng)第6天的未成熟DC(2×106)；④RAPA+iDC組(n=12)：術前3天單次尾靜脈注射LEW大鼠髓源性培養(yǎng)第6天的未成熟DC(2×106)，術后連續(xù)7天腹腔注射RAPA1mg/kg/day。術后14、2

17、8d隨機處死3只，測定肝功能、血清IL—2和IL-12，以及外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。每組各留6例觀察生存期。 結論：雷帕霉素對未成熟DC和已成熟DC刺激同種異基因T淋巴細胞增殖的能力都具有抑制作用。輸注供體髓源性未成熟DC聯(lián)合術后短期使用雷帕霉素的方法能明顯促進肝移植術后外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg的增殖，減輕大鼠肝移植術后免疫損傷并誘導免疫耐受。這種新的治療策略可能成為誘