自體乙?；T餌蛋白酵母雙雜合篩選體系的建立.pdf

1、到目前為止,所有與修飾后細蛋白結(jié)合的蛋白鑒定僅限于生物化學(xué)方法,而在基因組范圍內(nèi)的篩選工作還很少,有報道在細胞內(nèi)表達異源性的蛋白激酶,用雙雜合試驗進行翻譯后修飾特異性結(jié)合蛋白的篩選.如:在酵母中表達酪氨酸激酶或在大腸桿菌中表達哺乳動物絲氨酸/蘇氨酸激酶,以使底物磷酸化后再用雙雜合試驗來進行篩選.由于磷酸化過程依賴于傳統(tǒng)的酶-底物反應(yīng)(反式作用),如果外源性的酶難以從宿主細胞中眾多的蛋白中識別特異蛋白底物則接下來的篩選可能失敗.因此,為提

2、高底物磷酸化的效率,增加"誘餌"蛋白的特異性就必須過量表達激酶,而這樣可使宿主細胞中蛋白被不當修飾導(dǎo)致細胞生長停滯.為使細胞內(nèi)酵母雙雜合試驗"誘餌"蛋白能特異地、持續(xù)修飾,我們將Gcn5 HAT結(jié)構(gòu)域和組蛋白H3尾相連,這樣酶與底物的物理性連接可能使"自體催化"現(xiàn)象發(fā)生在一個蛋白分子內(nèi)而產(chǎn)生高效率的乙?；揎?我們將組蛋白H3尾(1-59位氨基酸)與Gcn5(18-252位氨基酸)野生型相連,再連接Ga14DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和HA;用無H

3、AT活性的Gcn5變異體作為對照.將含有上述融合蛋白ORF的質(zhì)粒和載體對照分別轉(zhuǎn)入酵母細胞中(PJ69-4 α),用抗HA和抗組蛋白H3K9/K14乙?；贵w檢測酵母全細胞提取液中人工融合蛋白的工作情況.我們還構(gòu)建了GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA和GAL4DBD-H4-Gcn5 F221A-HA重組體,試驗表明:GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA融合蛋白有自體乙?；F(xiàn)象(H4K8)而GAL4DBD-H4-Gc n5F

4、221 A-HA則無.為檢測融合蛋白能否用于酵母雙雜合篩選試驗,我們與華盛頓大學(xué)的Stanley Fields博士合作進行高通量酵母雙雜合篩選試驗.為探索Rmtl在體外甲基化活性與組蛋白乙?；年P(guān)系,我們提出了以下假設(shè):Rmt1甲基化那些已預(yù)先乙?；腍4或H3(位置尚待確定)之精氨酸,而那些乙?；恢每梢越Y(jié)合Rmt1.但因為Rmt1的靶組蛋白可能占有很少的百分比,或僅僅在特殊情況下才存在(即在某些基因開放時),因此RMT1缺陷不會造成