重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子新劑型研究.pdf

1、目的：重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子（Recombinant human granulocyte-macrophage stimulating factor，rhGM-CSF）是由骨髓分化而成，并可由骨髓前提細胞分離得到，它是一種非糖基化的水溶性蛋白質，由127個氨基酸組成。rhGM-CSF的主要作用是對粒細胞系和單核細胞系細胞的維持存活、促進生長、誘導分化和增強功能等?；谂R床研究的應用中發(fā)現rhGM-CSF應用于燙傷、燒傷等疾病領域，

2、并顯示了良好的療效。
　　 目前，臨床上主要采用注射劑含漱等治療途徑，考慮到局部外用治療，并保證安全、有效、穩(wěn)定、使用方便的前提，本課題研制了rhGM-CSF外用溶液劑型，主要用于皮膚的燙傷、燒傷等疾病。它可直接作用于患病部位，從而避免肝臟的首過效應和胃腸道的降解反應及有關的副作用，攜帶使用方便。
　　 方法：本實驗選擇重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子發(fā)酵液作為提取材料，在預試驗的基礎上初步確定重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的

3、制備方法。將大腸桿菌表達的rhGM-CSF經過超聲波破碎后收集包涵體，通過包涵體的變性和復性操作得到粗提的蛋白質，通過層析步驟得到提純的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子原液。
　　 rhGM-CSF外用溶液處方設計與篩選試驗分別考察了pH篩選，穩(wěn)定劑的篩選，透皮吸收促進劑的篩選。為了考察pH值對rhGM-CSF外用溶液.的生物活性的影響，在處方中其他成分用量固定的前提下，將不同用量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉對試驗樣品pH值的影響。本試

4、驗選擇不同的穩(wěn)定劑加入到制劑當中，HT、DB、TG和GT，通過25±2℃加速試驗，以選擇最佳的保護劑。確定保護劑后，在其他組分固定的情況下，將保護劑按照不同比例，加到樣品當中，通過25±2℃加速30天，最終確定處方用量。本試驗選擇TW、BZ、SD作為參考，通過25±2℃加速試驗來考察它們對于制劑穩(wěn)定性的影響。最后確定了rhGM-CSF外用溶液的最佳處方。
　　 處方確定后進行穩(wěn)定性考察，制備了三批GM-CSF制劑樣品，置于40±

5、2℃，254±2℃，2～10℃三種條件下放置，以考察任何rhGM-CSF外用溶液樣品的外觀、pH值、生物活性、無菌檢查等方面的變化情況。
　　 結合《中國藥典》中rhGM-CSF產品的要求及通則中對外用溶液產品的要求，制訂了GM-CSF外用溶液的質檢規(guī)程草案。分別對樣品外觀、pH值、效價測定、蛋白含量測定、裝量、無菌等方面進行了研究。
　　 rhGM-CSF外用溶液治療燒傷的藥效試驗：選用家兔為試驗模型，構建淺Ⅱ度燒傷實

6、驗模型，隨機分組，分別涂抹rhGM-CSF外用溶液（70μg/ml、35 μg/ml、15gg/ml）、rhGM-CSF原液（35 μg/ml）、外用溶液空白溶液、生理鹽水，每次涂抹3下，每次涂抹共約0.4ml，每天定時給2次，連續(xù)7天。
　　 rhGM-CSF外用溶液用于治療燙傷的藥效學實驗，選用家兔為試驗模型，構建燙傷模型，隨機分組，每只家兔的六處創(chuàng)面分別給予的藥物為：rhGM-CSF外用溶液70 μg/ml、35μg/ml

7、、15 μg/ml、rhGM-CSF原液35μg/ml、外用溶液空白溶液、生理鹽水。每次涂抹3下，每次涂抹共約0.4ml，每天定時給2次，連續(xù)7天。
　　 rhGM-CSF外用溶液對動物皮膚急性毒性試驗，觀察rhGM-CSF外用溶液對家兔完整皮膚及破損皮膚短期接觸所產生的毒性反應。急性毒性試驗和資料，是對藥物一次性給予大劑量的安全性考察，按照皮膚急性毒性的試驗要求，受試藥物劑量超過有效濃度的20倍時，仍未出現異常反映或死亡，即可

8、提示藥物的安全性。參考藥效試驗中的高劑量70 μg/ml，此實驗設計了1.4mg/ml。
　　 rhGM-CSF外用溶液刺激性研究，試驗包括皮膚過敏試驗和皮膚刺激試驗。實驗動物為豚鼠，按體重性別隨機均分組，每組5只雌雄各半。通過動物皮膚接觸受試物后，觀察機體免疫系統(tǒng)反應在皮膚上的表現或觀察藥物對家兔皮膚多次給藥所產生的刺激反應。
　　 結果：按照試驗設計從發(fā)酵液中提取rhGM-CSF原液。在篩方試驗中將不同pH值的試驗樣

9、品通過25±2℃加速30天，實驗結果顯示，磷酸氫二鈉的用量為29g/L，磷酸二氫鈉的用量為2.0g/L時，樣品pH值約為7.2，此時對rhGM-CSF外用溶液的生物活性影響小。
　　 通過25±2℃加速試驗，選擇最佳的保護劑為HZT.。在其他組分固定的情況下，將HZT.按不同比例，加到樣品當中，通過25±2℃加速30天，實驗結果顯示，HZT.用量為300g時，活性損失最小，當其濃度再增加時，就會導致樣品溶液粘度增加，最終確定處方

10、用量為300g/L。通過透皮劑研究選擇SD.作為制劑中的透皮吸收促進劑。
　　 處方確定后樣品穩(wěn)定性考察，通過三批樣品40±2℃、25±2℃條件下的初步穩(wěn)定性考察、4-8℃長期穩(wěn)定性，GM-CSF外用溶液樣品的外觀、pH值、無菌檢查、生物活性等各項指標均未發(fā)生明顯變化，樣品穩(wěn)定性較好。通過質量研究起草了rhGM-CSF外用溶液的質檢規(guī)程草案。
　　 rhGM-CSF外用溶液治療燒傷的藥效試驗中可以看到，rhGM-CSF外

11、用溶液組給藥后，燒傷創(chuàng)面愈合明顯加快，用t檢驗方法分析。試藥組與對照組比較有顯著差異，原液組與外用溶液空白溶液組比較也有明顯差異，表明rhGM-CSF外用溶液組與原液組對燒傷均有明顯的治療作用，外用溶液組較原液組效果好一些，說明制劑組方的合理性。
　　 rhGM-CSF外用溶液用于治療燙傷的藥效學實驗中可以看到，rhGM-CSF外用溶液組給藥后，燙傷創(chuàng)面愈合明顯加快，用t檢驗方法分析，試藥組與對照組比較有顯著差異，原液組與外用溶

12、液空白溶液組比較也有明顯差異，表明rhGM-CSF外用溶液組與原液組對燙傷均有明顯的治療作用，外用溶液組較原液組效果好一些，說明制劑組方的合理性。
　　 rhGM-CSF外用溶液對動物皮膚急性毒性試驗表明：各組家兔均活潑健康，飲食活動等都未見異常。劑量已超過預計臨床用量的20倍以上。提示rhGM-CSF外用溶液對皮膚無毒副作用，臨床用藥安全。
　　 局部刺激性實驗表明：給rhGM-CSF外用溶液和外用溶液空白溶液組動物均

13、未出現明顯紅斑和水腫，表明rhGM-CSF外用溶液對皮膚為弱致敏性。觀察藥物對家兔皮膚多次給藥所產生的刺激反應，受試家兔均未出現明顯紅斑和水腫（分值<0.5）表明rhGM-CSF外用溶液對家兔皮膚無刺激性。通過對動物的皮膚過敏性試驗、刺激性試驗證明了rhGM-CSF外用溶液外用是安全的。
　　 結論：本課題研制的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子外用溶液，以HZT.等為輔料，主要用于皮膚的燙傷、燒傷等疾病。充分發(fā)揮了生物制藥的優(yōu)勢具有