人羰基還原酶CBR1抑制劑的篩選及EGCG增效蒽環(huán)類藥抗腫瘤活性機(jī)制研究.pdf

1、蒽環(huán)類藥物是最有效的抗腫瘤的藥物之一,但是由于腫瘤細(xì)胞對(duì)此類藥物的天然或獲得性的耐受性以及藥物對(duì)正常組織的毒性,尤其是心臟毒性,使得蒽環(huán)類藥物在臨床應(yīng)用上受到限制。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人的羰基還原酶(carbonyl reductse1,CBR1,Genbank No.J04056),可以還原代謝葸環(huán)類抗腫瘤藥物,如柔紅霉素(DNR),阿霉素(DOX),生成相應(yīng)的醇代謝物,即柔紅霉素醇和阿霉素醇。代謝產(chǎn)物與藥物原型比較,抗腫瘤效果顯著減弱,還會(huì)

2、導(dǎo)致心臟毒性。同時(shí),細(xì)胞內(nèi)的CBR1的含量還會(huì)因?yàn)檩飙h(huán)藥物的作用而上調(diào)表達(dá)。CBR1對(duì)藥物的還原代謝的導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物耐受并增強(qiáng)了藥物的毒副作用。針對(duì)以上情況,以CBR1為靶,尋找開發(fā)它的抑制劑,與蒽環(huán)類抗癌藥物的聯(lián)用既可增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果,逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性,還可降低化療時(shí)的毒副作用。我們希望通過我們的工作,找到新的,抑制效果好并具有臨床應(yīng)用前景的CBR1抑制劑。
　　根據(jù)已知的CBR1抑制劑的結(jié)構(gòu)特征,我們通過搜索小分子結(jié)

3、構(gòu)數(shù)據(jù)庫(ACD、CNPD、MDDR)共收集到約180種類黃酮結(jié)構(gòu)類似物,并應(yīng)用AUTODOCK4程序,從中篩查新的CBR1抑制劑。分子對(duì)接結(jié)果顯示,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與CBR1有很好的結(jié)合親和性,很有可能成為新的CBR1抑制劑。而且,EGCG是茶葉中的天然活性成分,具有防癌抗癌,抗氧化等效應(yīng),臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。因此,為了研究EGCG能否作為抗癌藥物增效劑使用,因此我們重點(diǎn)選擇EGCG研究其抑制CBR1的分子機(jī)

4、制和對(duì)柔紅霉素抗腫瘤活性的影響。
　　為了檢測(cè)EGCG對(duì)CBR1活性抑制的分子機(jī)制,我們?cè)吮磉_(dá)并純化了重組CBRl蛋白。用大分子互作儀確認(rèn)了EGCG和CBR1的直接結(jié)合,親和常數(shù)為KD(M)=2.73e-6。建立體外酶活測(cè)試體系檢測(cè)EGCG對(duì)CBRl的抑制動(dòng)力學(xué)特征,包括檢測(cè)EGCG抑制CBRl的還原活性的IC50為0。58μM;EGCG和輔酶NADPH,EGCG和底物Isatin之間均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制關(guān)系;EGCG結(jié)構(gòu)中的沒食子

5、酸酯基為抑制CBR1實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵部位;EGCG抑制具有pH依賴性,pH的變化引起EGCG的質(zhì)子化狀態(tài)的改變,在中性和弱堿性條件(生理pH條件)EGCG去質(zhì)子化,表現(xiàn)出更強(qiáng)的對(duì)CBR1的抑制活性。
　　為了解析EGCG和CBR1的結(jié)合模式,我們對(duì)EGCG-CBR1的結(jié)合進(jìn)行分子模擬,點(diǎn)突變CBR1關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,EGCG的多酚羥基和CBR1活性中心氨基酸通過形成多氫鍵保證二者的結(jié)合。EGCG的沒食子酸酯基上的羥基占據(jù)

6、了CBR1的催化中心,阻礙了結(jié)合底物的進(jìn)一步催化。EGCG和CBR1結(jié)合區(qū)域外圍的堿性氨基酸Lys95和Arg231通過正電荷對(duì)去質(zhì)子化EGCG的吸引,提高EGCG在活性中心濃度,從而保證EGCG對(duì)CBR1高效抑制。
　　為了在細(xì)胞水平檢測(cè)EGCG對(duì)柔紅霉素抗腫瘤活性的增效。用自制CBR1的多克隆抗體篩查肝癌細(xì)胞內(nèi)源CBR1的表達(dá)量,在高表達(dá)CBR1的肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC7721.進(jìn)行EGCG和柔紅霉素的聯(lián)用,EGCG不

7、僅能增強(qiáng)柔紅霉素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用,還能增強(qiáng)藥物對(duì)細(xì)胞G2/M期阻滯的效果。
　　為了證明EGCG對(duì)柔紅霉素的增效作用是CBR1介導(dǎo)的,通過上調(diào)或RNAi下調(diào)細(xì)胞中CBR1的表達(dá)量后再進(jìn)行藥物聯(lián)用。用低表達(dá)的Hep3B細(xì)胞株,建立超量表達(dá)CBR1的穩(wěn)定細(xì)胞株,EGCG可以逆轉(zhuǎn)外源CBR1導(dǎo)致的細(xì)胞對(duì)DNR的耐藥性。對(duì)于高表達(dá)CBR1的HepG2,我們用特異RNAi來下調(diào)內(nèi)源CBR1的表達(dá)量,HepG2細(xì)胞對(duì)柔紅霉素敏感且EG

8、CG對(duì)柔紅霉素的增效作用也不顯著了。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證EGCG可以抑制細(xì)胞對(duì)柔紅霉素的代謝,我們使用HPLC來分離和測(cè)定細(xì)胞裂解液中的柔紅霉素代謝物——柔紅霉素醇的含量,隨著細(xì)胞裂解液中EGCG的濃度升高,柔紅霉素醇的含量梯度降低,說明EGCG通過有效地降低柔紅霉素的代謝對(duì)藥物作用增效。
　　為了在整體動(dòng)物水平檢測(cè)EGCG和柔紅霉素聯(lián)用的效果,建立檢測(cè)化合物體內(nèi)作用的人SMMC7721裸鼠移植瘤模型。EGCG對(duì)柔紅霉素抑制

9、腫瘤有顯著的增效作用。測(cè)定藥物作用前后裸鼠的體重變化,結(jié)果顯示EGCG不僅自身無毒,還可顯著的緩解柔紅霉素毒性引起的裸鼠體重的減輕。
　　綜上所述,為了篩查新的CBR1抑制劑,我們搜索小分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫收集了180余種類黃酮結(jié)構(gòu)類似物,以CBR1晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行了分子對(duì)接,并依據(jù)對(duì)接結(jié)果的指導(dǎo),選擇了具有臨床應(yīng)用前景的EGCG進(jìn)行研究,我們從分子動(dòng)力學(xué),細(xì)胞毒理學(xué)和動(dòng)物藥理學(xué)水平,結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助結(jié)構(gòu)模擬和HPLC測(cè)定藥物代謝,對(duì)E