人羰基還原酶CBR1抑制劑的篩選及EGCG增效蒽環(huán)類藥抗腫瘤活性機制研究.pdf

1、蒽環(huán)類藥物是最有效的抗腫瘤的藥物之一,但是由于腫瘤細胞對此類藥物的天然或獲得性的耐受性以及藥物對正常組織的毒性,尤其是心臟毒性,使得蒽環(huán)類藥物在臨床應(yīng)用上受到限制。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人的羰基還原酶(carbonyl reductse1,CBR1,Genbank No.J04056),可以還原代謝葸環(huán)類抗腫瘤藥物,如柔紅霉素(DNR),阿霉素(DOX),生成相應(yīng)的醇代謝物,即柔紅霉素醇和阿霉素醇。代謝產(chǎn)物與藥物原型比較,抗腫瘤效果顯著減弱,還會

2、導(dǎo)致心臟毒性。同時,細胞內(nèi)的CBR1的含量還會因為蒽環(huán)藥物的作用而上調(diào)表達。CBR1對藥物的還原代謝的導(dǎo)致腫瘤細胞對藥物耐受并增強了藥物的毒副作用。針對以上情況,以CBR1為靶,尋找開發(fā)它的抑制劑,與蒽環(huán)類抗癌藥物的聯(lián)用既可增強藥物的抗腫瘤效果,逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性,還可降低化療時的毒副作用。我們希望通過我們的工作,找到新的,抑制效果好并具有臨床應(yīng)用前景的CBR1抑制劑。
　　根據(jù)已知的CBR1抑制劑的結(jié)構(gòu)特征,我們通過搜索小分子結(jié)

3、構(gòu)數(shù)據(jù)庫(ACD、CNPD、MDDR)共收集到約180種類黃酮結(jié)構(gòu)類似物,并應(yīng)用AUTODOCK4程序,從中篩查新的CBR1抑制劑。分子對接結(jié)果顯示,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與CBR1有很好的結(jié)合親和性,很有可能成為新的CBR1抑制劑。而且,EGCG是茶葉中的天然活性成分,具有防癌抗癌,抗氧化等效應(yīng),臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。因此,為了研究EGCG能否作為抗癌藥物增效劑使用,因此我們重點選擇EGCG研究其抑制CBR1的分子機

4、制和對柔紅霉素抗腫瘤活性的影響。
　　為了檢測EGCG對CBR1活性抑制的分子機制,我們原核表達并純化了重組CBRl蛋白。用大分子互作儀確認了EGCG和CBR1的直接結(jié)合,親和常數(shù)為KD(M)=2.73e-6。建立體外酶活測試體系檢測EGCG對CBRl的抑制動力學(xué)特征,包括檢測EGCG抑制CBRl的還原活性的IC50為0。58μM;EGCG和輔酶NADPH,EGCG和底物Isatin之間均為非競爭性抑制關(guān)系;EGCG結(jié)構(gòu)中的沒食子

5、酸酯基為抑制CBR1實現(xiàn)的關(guān)鍵部位;EGCG抑制具有pH依賴性,pH的變化引起EGCG的質(zhì)子化狀態(tài)的改變,在中性和弱堿性條件(生理pH條件)EGCG去質(zhì)子化,表現(xiàn)出更強的對CBR1的抑制活性。
　　為了解析EGCG和CBR1的結(jié)合模式,我們對EGCG-CBR1的結(jié)合進行分子模擬,點突變CBR1關(guān)鍵氨基酸殘基進行驗證。結(jié)果顯示,EGCG的多酚羥基和CBR1活性中心氨基酸通過形成多氫鍵保證二者的結(jié)合。EGCG的沒食子酸酯基上的羥基占據(jù)

6、了CBR1的催化中心,阻礙了結(jié)合底物的進一步催化。EGCG和CBR1結(jié)合區(qū)域外圍的堿性氨基酸Lys95和Arg231通過正電荷對去質(zhì)子化EGCG的吸引,提高EGCG在活性中心濃度,從而保證EGCG對CBR1高效抑制。
　　為了在細胞水平檢測EGCG對柔紅霉素抗腫瘤活性的增效。用自制CBR1的多克隆抗體篩查肝癌細胞內(nèi)源CBR1的表達量,在高表達CBR1的肝癌細胞株HepG2和SMMC7721.進行EGCG和柔紅霉素的聯(lián)用,EGCG不

7、僅能增強柔紅霉素對肝癌細胞增殖的抑制作用,還能增強藥物對細胞G2/M期阻滯的效果。
　　為了證明EGCG對柔紅霉素的增效作用是CBR1介導(dǎo)的,通過上調(diào)或RNAi下調(diào)細胞中CBR1的表達量后再進行藥物聯(lián)用。用低表達的Hep3B細胞株,建立超量表達CBR1的穩(wěn)定細胞株,EGCG可以逆轉(zhuǎn)外源CBR1導(dǎo)致的細胞對DNR的耐藥性。對于高表達CBR1的HepG2,我們用特異RNAi來下調(diào)內(nèi)源CBR1的表達量,HepG2細胞對柔紅霉素敏感且EG

8、CG對柔紅霉素的增效作用也不顯著了。
　　為了進一步驗證EGCG可以抑制細胞對柔紅霉素的代謝,我們使用HPLC來分離和測定細胞裂解液中的柔紅霉素代謝物——柔紅霉素醇的含量,隨著細胞裂解液中EGCG的濃度升高,柔紅霉素醇的含量梯度降低,說明EGCG通過有效地降低柔紅霉素的代謝對藥物作用增效。
　　為了在整體動物水平檢測EGCG和柔紅霉素聯(lián)用的效果,建立檢測化合物體內(nèi)作用的人SMMC7721裸鼠移植瘤模型。EGCG對柔紅霉素抑制

9、腫瘤有顯著的增效作用。測定藥物作用前后裸鼠的體重變化,結(jié)果顯示EGCG不僅自身無毒,還可顯著的緩解柔紅霉素毒性引起的裸鼠體重的減輕。
　　綜上所述,為了篩查新的CBR1抑制劑,我們搜索小分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫收集了180余種類黃酮結(jié)構(gòu)類似物,以CBR1晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進行了分子對接,并依據(jù)對接結(jié)果的指導(dǎo),選擇了具有臨床應(yīng)用前景的EGCG進行研究,我們從分子動力學(xué),細胞毒理學(xué)和動物藥理學(xué)水平,結(jié)合計算機輔助結(jié)構(gòu)模擬和HPLC測定藥物代謝,對E