肺炎鏈球菌HMG-CoA還原酶的性質(zhì)研究及抑制劑篩選.pdf

1、肺炎鏈球菌是引起腦膜炎、敗血癥、肺炎等疾病的主要病原菌，全球每天由于這種病菌而死亡的人數(shù)達(dá)到了約3700人，其中大多數(shù)為抵抗力較弱的兒童。并且由于環(huán)境的污染，抗生素的大量不良使用等原因已經(jīng)使得肺炎鏈球菌對傳統(tǒng)抗菌藥物的抗性增強(qiáng)，所以尋找新的靶標(biāo)及抗生素意義深遠(yuǎn)。
　　 類異戊二烯在自然界中非常常見，它具有很多重要的生物功能，所以研究類異戊二烯的形成途徑，尋找合適的靶標(biāo)吸引了很多研究者的注意。在生物體內(nèi)，類異戊二烯的生成有兩種途徑

2、，一種為甲羥戊酸途徑，另外一種為非甲羥戊酸途徑。在肺炎鏈球菌中，異戊二烯的合成主要采用甲羥戊酸途徑。我們選取的靶標(biāo)是甲羥戊酸途徑中的3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)，功能是催化3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原生成甲羥戊酸，是甲羥戊酸形成過程的限速酶。我們的研究主要從下面幾個(gè)方面進(jìn)行：
　　 (1)根據(jù)已有的假單胞菌的HMGR晶體結(jié)構(gòu)，同源模建出肺炎鏈球菌的晶體結(jié)構(gòu)用于篩選可能的靶標(biāo)化合物，我們篩選出了D7S系列化合物和LH

3、系列化合物。
　　 (2)對虛擬篩選出來的化合物進(jìn)行生物活性測試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明D7S系列的化合物對HMGR的抑制作用比較明顯，IC50在幾十個(gè)微摩爾。抑制效果最好的化合物D7S21的IC50為11.3μM。
　　 (3)為了找出抑制效果較好的化合物的結(jié)合位點(diǎn)，我們將化合物對接到模建的蛋白結(jié)構(gòu)中。對接的結(jié)果顯示化合物與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)是K263、N212、H378。這幾個(gè)位點(diǎn)中H378是重要的催化殘基，而K263即使重要的催

4、化位點(diǎn)也是重要的結(jié)合位點(diǎn)，而N212A是輔因子NADPH的重要結(jié)合位點(diǎn)，所以我們推測原因是化合物占據(jù)了部分底物和輔因子的活性位點(diǎn)，阻礙了底物和輔因子與酶的結(jié)合從而抑制酶的活性。我們采用了結(jié)合位點(diǎn)突變體酶活測試和突變體蛋白熒光猝滅兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證對接的結(jié)果。
　　 (4)結(jié)合位點(diǎn)的突變體中有活性的只有Q382A和結(jié)合位點(diǎn)N212D有活性。Q382的主要作用是穩(wěn)定既是重要催化位點(diǎn)也是化合物重要結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基H378，但是自身與

5、化合物并沒有直接相互作用。N212是輔因子NADPH的重要的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)也是化合物的結(jié)合位點(diǎn)，突變成A則失去活性，所以突變成D，保留一部分活性和結(jié)合能力。測試結(jié)果表明相比較于野生型，作為代表的化合物D7S21和D7S14對Q3S2A和N212D的抑制作用有所減弱，對Q382A的IC50增大了2倍，對N212D的IC50增大了3倍。
　　 (5)由于其它一些結(jié)合位點(diǎn)的突變體，如K263A、H378A、N212A都失去生物活性，所

6、以我們用熒光猝滅的方法加以驗(yàn)證。熒光猝滅結(jié)果顯示突變體與化合物的結(jié)合能力均比野生型要差，突變體與化合物的結(jié)合常數(shù)都大幅減小，其中結(jié)合能力最差的是Q382A和K263A，結(jié)合常數(shù)從野生型的14×104M-1降到了1.3×104和0.95×104 M-1，降低了一個(gè)數(shù)量級。
　　 由酶活和熒光的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示N212、H378、K263是化合物的重要結(jié)合位點(diǎn)，抑制劑很有可能是通過與這些結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合而阻礙底物和輔因子的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)抑制酶