視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）與妊娠糖尿病的相關(guān)性研究.pdf

1、一、研究背景和目的： 妊娠糖尿病是指在妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的糖尿病。GDM在全球的發(fā)病率正在逐年上升，而亞洲女性與其他種族相比發(fā)病率較高。GDM是T2DM的高危因素，遺傳背景在其發(fā)病中也起著重要的作用。根據(jù)既往文獻報道以及本研究的臨床資料分析，胰島素抵抗是GDM的重要特征。本研究的主要目的是研究GDM孕婦的臨床特征，并探討一種與胰島素抵抗相關(guān)的新型脂肪因子RBP4在DNA水平、RNA水平和蛋白表達水平與GDM的關(guān)系。 二

2、、研究方法： 1)臨床資料庫的建立I.研究對象為2005年9月至2008年3月在北京協(xié)和醫(yī)院就診并常規(guī)產(chǎn)前隨診的中國籍孕婦。孕24-28周行CCT，1h血漿葡萄糖濃度≥7.8mmol/L的孕婦，一周后行100g OGTT，GDM診斷標準為ADA標準。共納入1595人，其中GCT1h血漿葡萄糖濃度<7.8 mmol/L即GCT陰性孕婦290人，GDM共488人，IGT共235人，NGT582人。 2)SNP分型：

3、Ⅰ.病例組共分型505例，對照組共分型687例Ⅱ.提取血液基因組DNA，PCR技術(shù)得到目的片斷。Ⅲ.用LDR方法對RBP4基因rs 3758538(-1265A>C)，rs 3758539(-803G>A)，rs 12265684(+6969C>G)，rs 10882273(+1188lT>C)的SNP進行分型。Ⅳ.用直接測序法進行證實。 3)血清RBP4檢測Ⅰ共測定143例孕婦，GDM組為74例，NGT組為69例，均留取OGT

4、T試驗時空腹血樣，分離血清。Ⅱ.RBP4(人)ELISA試劑盒測定血清RBP4水平。 4)脂肪組織RBP4的RNA及蛋白表達水平分析1.2007年11月至2008年1月收集在我院進行擇期剖腹產(chǎn)孕婦的皮下脂肪，共41例，GCT陰性13例、GDM 17例、IGT 2例、NGT 9例，仍將NGT與GCT陰性組合并為對照組，GDM+IGT合并為病例組。 Ⅱ.GCT陰性組因未采集到血樣，從脂肪組織提取基因組DNA，LDR進行SNP

5、分型。 Ⅲ.提取總RNA，RT-PCR測定RBP4 mRNA的相對表達水平。 Ⅳ.Western blotting測定RBP4蛋白的相對表達水平。 三、研究結(jié)果： 1.臨床資料部分Ⅰ.從GCT陰性→NGT→IGT→GDM組，隨著血糖水平的增高，研究對象的年齡、孕產(chǎn)次、孕前BMI(GCT陰性組未收集到孕前BMI，僅有初次產(chǎn)檢時的BMI，因此未納入兩兩比較)，糖尿病家族史陽性率，初次產(chǎn)檢的血壓、ALT、WBC

6、總數(shù)、以及OGTT檢查時的TG、CRP、各點的真胰島素呈現(xiàn)升高趨勢；血BUN、Cr、CHO、HDL、LDL均未見統(tǒng)計學差異。 Ⅱ.反映胰島素敏感性的指標在GDM組→IGT組→NGT組依次降低，而反應β細胞功能的指標在GDM組較IGT及NGT組降低，但IGT和NGT組之間并沒有統(tǒng)計學差異且均數(shù)十分接近。評價胰島素敏感性的指標中較為合理的是引入OGTT過程中血糖和胰島素變化的指標ISI-OGTT指數(shù)，而評價β細胞功能的指標中，較為合

7、適的是第1時相胰島素分泌指數(shù)和第2時相胰島素分泌指數(shù)。 Ⅲ.在Logisfic回歸中，孕前BMI升高、TG升高、糖尿病家族史陽性均為發(fā)生高血糖的獨立危險因素，且危險系數(shù)高低排序為糖尿病家族史>TG>孕前BMI。 2.SNP分型部分Ⅰ.HWE平衡檢驗：無論是在總體人群、病例組或?qū)φ战M，4個SNP位點均符合HWE。 Ⅱ.各SNP位點的病例對照研究：24個SNP位點的等位基因頻率和/或等位基因型在病例對照研究中的差異達

8、到了統(tǒng)計學意義，它們是：rs3758539 G vsA，OR=1.446，95％CI 1.095-1.911，P=0.009；rs3758539 GG vsAG+AA，OR1.532，95％CI 1.131-2.075；rs12265684 C vs G，OR=1.296，95％CI 1.014-1.658。經(jīng)過Logistic回歸對年齡、孕次、產(chǎn)次、孕前體重、收縮壓、舒張壓、CHO、TG和糖尿病家族史等因素校正后，3個SNP位點的ma

9、jor homo基因型較hetero+minor homo基因型為GDM的獨立危險因素，它們?yōu)椋簉s3758539 GG VS AG+GG OR=1.832，95％CI1.252-2.680，P=0.002；rs12265684 CC vs CG+GG， OR=1.757，95％CI1.234-2.458，P=0.001；rs10882273，OR=1.678，95％CI 1.189.2.370，P=0.003。 Ⅲ.各基因型間

10、臨床及生化指標比較：4個SNP位點的基因型分布與年齡、孕前BMI、糖尿病家族史陽性率、血壓、胰島素敏感性和13細胞功能的指標均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異。rs12265684 CC基因型較CG+GG基因型HbA1c升高(5.42±0.53 VS 5.31±O.41，P=0.010)；rs10882273 TT基因型較CT+CC基因型HbA1c也升高(5.42±0.54 VS 5.31±0.42，P=0.021)，而rs3758539似乎與血糖水平

11、最為密切，GG基因型較AG+AA基因型，HbA1c、2hoGTT，3hOGTT均升高(HbA1c 5.44±.52 vs 5.29±0.42，P=0.006，2hOGTT glucoselevel 8.40±1.70 vs 8.11±1.44，P=0.042，3hOGTT glucose level 7.38±1.47 vs7.09±1.17.P=0.009)。 Ⅳ.4個ShIP位點的LD檢驗以及單倍型的病例對照研究：rs375

12、8539與其它位點無連鎖關(guān)系，而rs3758539、rsl2265684、rs10882273這三個位點在1個長約12kb的LD block內(nèi)，可以進行單倍型構(gòu)建。通過Haplovicw計算得出，4種單倍型中有2種與GDM有關(guān)：GCT單倍型在病例組分布頻率較對照組升高(86.0％vs 82.3％)，P=0.016，OR為1.322(1.05~1.659)；AGC單倍型在病例組分布頻率較對照組降低(8.7％vs 11.3％)，P=0.03

13、8，OR為0.746(0.566~0.985)。 Ⅴ.樣本量及檢驗效能的驗證：用Quanto軟件進行樣本量的檢驗，證實以目前的樣本量，我們有>85％的檢驗效能(P=0.05)統(tǒng)計出MAF>10％，OR值>1.5的等位基因在病例對照組中的差異。 3.血清RBP4測定部分Ⅰ.GDM組的RBP4均值較NGT組僅有升高的趨勢(21.53±5.96ug/ml vs20.84±4.31ug/ml，P=0.429)，經(jīng)過年齡、孕前BM

14、I、OGTT孕周校正后兩者比較沒有統(tǒng)計學差異。 Ⅱ.血清RBP4水平在rs 3758539、rs 12265684、rs 10882273的major homo基因型均較minor homo+hetero基因型的RBP4水平有升高趨勢，但均未見統(tǒng)計學差異。 Ⅲ.在相關(guān)性分析中，血清RBP4水平和年齡、孕前BMI、TG呈正相關(guān)，和ISI-OGTT指數(shù)呈現(xiàn)弱負相關(guān)(correlation=-0.199，P=0.017)；經(jīng)多

15、元線性回歸分析校正混雜因素，發(fā)現(xiàn)與RBP4水平獨立相關(guān)的指標是TG(標準偏回歸系數(shù)beta=0.331，P=0.000)和年齡(標準偏回歸系數(shù)beta=0.194，P=0.018)，并以TG與RBP4的關(guān)系最為密切。 4.脂肪組織RBP4的RNA及蛋白表達部分Ⅰ.脂肪組織RT-PCR結(jié)果A)病例組的RBP4 mRNA表達水平較對照組(1.438 vs 1.034，P=0.025，經(jīng)年齡、孕前BMI校正)有統(tǒng)計學差異的升高。

16、 B)RBP4mRNA的表達和rs 3758539基因型的關(guān)系：GG型轉(zhuǎn)錄活性較從+AG型有升高的趨勢(1.271 vS 1.007，P=0.185)，然而P值尚未達到統(tǒng)計學差異。 Ⅱ.脂肪組織western blotting結(jié)果A)病例組RBP4/β-actin的比值均值略高于對照組(0.779 vs 0.738，P=0.617)，P值沒有統(tǒng)計學差異。 B)與rs 3758539不同基因型的比較：GG型較AG+AA的

17、比值升高(0.774 vs0.695，P=0.419)，P值未達到統(tǒng)計學差異。 四、結(jié)論： 本研究表明RBP4的rs3758539、rs12265684、rs10882273在一個連鎖不平衡的block內(nèi)，這3個SNP位點均與妊娠期血糖升高有關(guān)，其中rs3758539位點G等位基因以及GG等位基因型、rs12265684位點的C等位基因以及CC等位基因型以及rs10882273位點的TT等位基因型均是GDM的易感因素。由

18、3個SNP位點組成的G-C-T單倍型為致病型單倍體；AGC單倍型為保護型單倍體。上述這些結(jié)果均表明RBP4的基因多態(tài)性與中國婦女的GDM發(fā)生相關(guān)。 在轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)病例組脂肪組織RBP4mRNA表達水平較對照組升高。在血清RBP4蛋白表達水平及脂肪RBP4蛋白表達水平，病例組雖有升高的趨勢但尚未見統(tǒng)計學差異。無論是在血清水平還是脂肪組織RNA或蛋白水平，rs3758539 GG基因型較AA+AG基因型均有升高趨勢但未達到統(tǒng)計學差