致密核心囊泡調(diào)控蛋白作用機(jī)制研究.pdf

1、囊泡的運(yùn)輸涉及轉(zhuǎn)運(yùn),錨定等多個(gè)步驟,這些步驟是由許多蛋白質(zhì)參與完成的。這些步驟的確切劃分和其中起作用的眾多蛋白質(zhì)的相互作用目前尚不十分清楚。在當(dāng)前研究中,致密核心囊泡(Dense Core Vesicles,DCVs)和突觸囊泡(Synaptic Veslcles,SVs)的基本分泌機(jī)制是類(lèi)似的,而同時(shí)DCVs和SVs特性上的諸多差異又預(yù)示了這兩類(lèi)囊泡在分泌過(guò)程中使用了不同的分子。因此,SVs中相關(guān)蛋白的研究為研究DCVs提供了很多參考

2、。本文利用全細(xì)胞膜電容檢測(cè)技術(shù),碳纖電極電化學(xué)檢測(cè)技術(shù),結(jié)合全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)的手段,對(duì)DCVs運(yùn)輸相關(guān)調(diào)控蛋白機(jī)制做了一定的研究。
　　本文在大鼠嗜鉻細(xì)胞的瘤細(xì)胞(PC12)上研究了Synaptotagmin I,Synaptotagmin IX的對(duì)細(xì)胞胞吐的影響。目前尚不清楚各種Synaptotagmin Syt亞型是獨(dú)立調(diào)控不同類(lèi)型的囊泡還是協(xié)同作用。通過(guò)使用short hairpin RNA(shRNA)對(duì)S

3、yt I,Syt IX的表達(dá)進(jìn)行沉默,通過(guò)電化學(xué)分析(碳纖電極的使用)和Tirfm的方法檢測(cè)的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)Syt I和Syt IX表達(dá)量同時(shí)下調(diào)導(dǎo)致鈣依賴的大囊泡胞吐顯著減少,而單獨(dú)下調(diào)沒(méi)有顯著影響。同時(shí)Syt I和Syt IX表達(dá)量同時(shí)下調(diào)是更多的囊泡以―kiss-and-run‖的方式胞吐。結(jié)果表明Syt I和Syt IX冗余作用于Ca2+觸發(fā)的大囊泡釋放和融合孔擴(kuò)張。
　　本文還在模式生物線蟲(chóng)的神經(jīng)元胞體(ALA)上進(jìn)行了Ra

4、b27和Rab3對(duì)致密核心囊泡分泌的調(diào)控機(jī)制研究。秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)在突觸傳遞的研究中顯示了極大的優(yōu)勢(shì),但是缺乏直接監(jiān)測(cè)DCVs分泌過(guò)程的功能分析手段。通過(guò)采用本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)創(chuàng)的膜電容檢測(cè)和全內(nèi)反射熒光顯微成像的技術(shù)方法以及結(jié)合突變體的分析研究表明Rab27是DCVs胞吐活動(dòng)中起重要作用。其機(jī)制與Rab3有冗余作用,對(duì)于囊泡的錨定和使囊泡穩(wěn)定在錨定狀態(tài)有重要影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Rab27和可能的下游受體R