Bit1蛋白對胰腺癌惡性表型調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，其發(fā)病隱匿、進展迅速、手術(shù)切除率低、放化療效果不佳，預(yù)后極差，總體5年生存率不到5％，在全球癌癥發(fā)病率中占第13位，排在所有惡性腫瘤致死原因的第四位。大多數(shù)的胰腺癌患者往往確診時已出現(xiàn)淋巴或血運轉(zhuǎn)移，從而失去了根治性手術(shù)治療的機會。胰腺癌患者死亡的主要原因是腫瘤早期即發(fā)生局部侵襲或遠處轉(zhuǎn)移，也是制約患者預(yù)后的主要因素。目前胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制尚不明確，了解胰腺癌的惡性生物學(xué)行為發(fā)生機制，并給予適當?shù)母深A(yù)措

2、施，對于提高胰腺癌的臨床診治水平并改善患者的預(yù)后具有十分重要的現(xiàn)實意義。同時篩選最佳的預(yù)后標志物，對于臨床醫(yī)師選擇恰當?shù)闹委煼桨?，避免不必要的治療帶來的毒副作用，具有一定的臨床指導(dǎo)意義。
　　Bit1(Bcl-2 inhibitor of transcription1)是2004年發(fā)現(xiàn)的一個與細胞失巢凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)，其正常定位于線粒體內(nèi)膜，目前其確切生理功能尚未完全清楚。初期研究發(fā)現(xiàn)當細胞與細胞外基質(zhì)失偶聯(lián)即受到失黏附信號刺激時

3、，Bit1蛋白從線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移至細胞胞漿中，拮抗胞質(zhì)中的TLE1蛋白，并通過與胞漿中的轉(zhuǎn)錄共調(diào)解因子AES(amino-terminal enhancer of split)蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)復(fù)合物，啟動一種特殊的凋亡形式，即非caspase（半胱氨酸蛋白酶）途徑依賴的凋亡。目前研究認為腫瘤細胞的失巢凋亡抵抗與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)，其中腫瘤細胞的EMT(Epithelial-MesenchymalTransition)過程

4、在其中起著至關(guān)重要的作用。鑒于胰腺癌細胞的高侵襲性及轉(zhuǎn)移能力強的特點，了解Bit1蛋白與胰腺癌細胞失巢凋亡的相關(guān)性及對侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討其對胰腺癌細胞惡性生物學(xué)行為的作用機制，對于加深我們對胰腺癌分子機理的認識及尋找新的診斷或治療靶點具有十分重要的意義。
　　目的:
　　1.觀察Bit1蛋白在六株胰腺癌細胞系中的表達情況及對胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。
　　2.探索Bit1蛋白對胰腺癌細胞生物學(xué)行為的

5、影響機制。
　　3.探討B(tài)it1蛋白在胰腺癌病人組織中的表達情況以及與胰腺癌病人臨床病理特征的相關(guān)性及對預(yù)后的影響。
　　方法:
　　1.Western blot及Quantitative Real-time PCR技術(shù)檢測六株胰腺癌細胞株中Bit1的基礎(chǔ)表達情況。通過慢病毒載體將Bit1的干擾的質(zhì)?；蜻^表達Bit1基因的質(zhì)粒分別導(dǎo)入胰腺癌細胞株P(guān)anc-1和Mia paca2細胞中，通過抗性篩選，建立穩(wěn)定沉默和穩(wěn)定過

6、表達Bit1的胰腺癌細胞株。
　　2.CCK8法檢測Bit1對胰腺癌細胞增殖及化療敏感性的影響，利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡，western blot檢測Bit1蛋白影響胰腺癌細胞增殖活性及化療敏感性的具體作用形式;利用Transwell和劃痕實驗檢測Bit1與胰腺癌細胞運動、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，western blot檢測其可能的作用機制。
　　3.應(yīng)用western blot和免疫共沉淀技術(shù)檢測Bit1蛋白影響胰

7、腺癌細胞惡性表型的相關(guān)機制。
　　4.利用胰腺癌組織微陣列平臺結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry，IHC)檢測胰腺癌病人癌組織及癌旁組織中Bit1的表達情況，分析Bit1與胰腺癌病人臨床病理特征及胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.在實驗室已驗證的六株胰腺癌細胞株中，Panc-1胰腺癌細胞株在mRNA及蛋白水平的Bit1表達是最高的，而Mia paca2細胞的表達是最低的。以Panc

8、-1及Mia paca2為親本株分別成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默以及過表達Bit1蛋白的胰腺癌細胞株。
　　2.敲低Bit1的表達并未明顯影響胰腺癌Panc-1細胞株的增殖，但可抑制懸浮培養(yǎng)Panc1細胞的凋亡，增加貼壁培養(yǎng)細胞的化療敏感性并促進其凋亡。然而，在胰腺癌Mia paca2細胞過表達Bit1蛋白后，胰腺癌Mia paca2細胞的增殖亦無明顯差異，但可增加懸浮培養(yǎng)胰腺癌細胞的凋亡比例，抑制貼壁培養(yǎng)的胰腺癌細胞的化療敏感性并抑制其凋亡

9、。Bit1敲減的胰腺癌Panc1細胞的運動侵襲能力明顯增強，而過表達Bit1蛋白后胰腺癌Mia paca2細胞的運動侵襲能力受到抑制。
　　3.Western blot顯示Bit1通過影響caspase3、PARP、cleaved caspase3以及cleavedPARP的表達影響胰腺癌細胞的凋亡，并通過改變一系列上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過程相關(guān)蛋白的表達影響腫瘤細胞的運動侵襲以及轉(zhuǎn)移能力。Bit1可能通過調(diào)控Erk通路的活性影響

10、胰腺癌細胞的運動侵襲能力。
　　4.對人胰腺癌組織微陣列切片進行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bit1蛋白在胰腺癌病人癌旁組織的表達水平顯著高于癌組織(P＜0.05)，且Bit1在胰腺癌組織中的表達水平與病人血清中的CEA水平以及神經(jīng)浸潤有相關(guān)性(P＜0.05)。單因素生存分析顯示，飲酒、腫瘤分化程度、N分期、M分期和TNM分期與預(yù)后有相關(guān)性（P＜0.05），多因素Cox比例風險回歸模型提示飲酒、N1期、TNM分期中的Ⅲ-Ⅳ期是患者不

11、良預(yù)后的獨立危險因素(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　Bit1蛋白在胰腺癌細胞系中的表達存在明顯差異，Bit1對胰腺癌細胞的增殖無明顯影響，但敲低Bit1可促進腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，并影響其化療敏感性。Bit1蛋白可通過調(diào)控胰腺癌細胞的EMT表型來影響腫瘤細胞的運動侵襲能力，其過程可能與Erk通路的激活存在關(guān)聯(lián)性。Bit1蛋白在胰腺癌組織中低表達，并與胰腺癌的神經(jīng)浸潤密切相關(guān)，Biti蛋白可能與其他臨床指標結(jié)合共同影響胰腺