控制性超排卵中卵泡期孕酮水平的影響及生長(zhǎng)激素應(yīng)用的研究.pdf

1、控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)是指通過(guò)運(yùn)用促排卵藥物使得一個(gè)月經(jīng)周期能夠獲得足夠數(shù)量的卵子，以便得到多個(gè)可供移植的胚胎。COH 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于體外受精一胚胎移植 (in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)治療不孕癥中，并成為治療中的關(guān)鍵步驟之一。20多年來(lái)隨著輔助生殖技術(shù)(assistedreproductive tech

2、nology，ART)的不斷開展與深入研究，用于ART的藥物有了很大的發(fā)展、COH方案和監(jiān)測(cè)手段不斷得以完善。雖然臨床妊娠率在不斷提高，然而在啟動(dòng)周期中仍有超過(guò)半數(shù)的未能成功，目前探討并改善影響成功率的因素已成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門話題。卵子成熟障礙，卵巢反應(yīng)低下，受精失敗，胚胎發(fā)育障礙，著床障礙等都是IVF-ET失敗的原因。 本課題分為兩大部分，主要研究方法和結(jié)果如下： 第一部分COH中卵泡早、晚期孕酮水平對(duì)IVF結(jié)局的

3、影響 本部分的研究工作是對(duì)部分接受IVF助孕的不孕癥患者的COH資料進(jìn)行回顧性分析，探討卵泡早期孕酮水平對(duì)IVF結(jié)局的影響。首先我們對(duì)2003年5月至2005年1月538名接受垂體降調(diào)節(jié)短方案超排患者的卵泡早期孕酮水平進(jìn)行分析。根據(jù)她們?cè)谧⑸浯傩韵偌に?Gonadotropin，Gn)第4天的血清孕酮水平分為三組：A組，血清孕酮≤lng/ml者367例；B組，血清孕酮lng/ml-3 ng/ml者106例；C 組，血清孕酮>3

4、ng/ml 者65例，回顧性分析各組患者的一般資料、COH資料及IVF結(jié)局。 結(jié)果：各組間注射hCG 日的E2，LH，P 水平，獲卵數(shù)，移植胚胎數(shù)均無(wú)顯著差異。受精率，優(yōu)質(zhì)胚胎率隨著孕酮水平的升高逐漸降低，但無(wú)顯著差異。我們發(fā)現(xiàn)B和C組超排卵第4天黃體生成素水平和孕酮水平比A組顯著升高(P<0.01)，雌激素也顯著升高(P 分別<0.05和<0.01)；C組的妊娠率和著床率比A組顯著降低(P<0.01)；而早期流產(chǎn)率顯著增高(P

5、<0.05)：所以繼續(xù)妊娠率較A組顯著降低(P<0.01)，C組的著床率比B組顯著降低，但是早期流產(chǎn)率沒有顯著差異。B組的早期流產(chǎn)率較A組顯著升高(P<0.05)。 結(jié)論：控制性超排卵中短方案垂體降調(diào)節(jié)中，注射Gn第4天，即卵泡早期孕酮水平>3 ng/ml，胚胎著床率，妊娠率降低，孕酮水平>1 ng/ml，早期流產(chǎn)率增加。接著，對(duì)2003年4月至2004年12月1408例不孕癥患者，分別接受短方案垂體降調(diào)節(jié)692人和長(zhǎng)方案垂體降

6、調(diào)節(jié)716人卵泡晚期的孕酮水平進(jìn)行分析，其中，按照注射HCG日血清孕酮濃度的不同分別分為 3 組：短方案組：血清孕酮≤lng/ml 者462例，血清孕酮lng/ml-2 ng/ml 者211例，血清孕酮>2 ng/ml者19例；長(zhǎng)方案組：血清孕酮≤lng/ml者588例，血清孕酮lng/ml-2 ng/ml者108例，血清孕酮>2 ng/ml者20例，回顧性分析體外受精的結(jié)局。 結(jié)果：長(zhǎng)短方案各組間獲卵數(shù)，受精率，卵裂率，優(yōu)胚率

7、無(wú)明顯差異，隨著孕酮水平的升高，著床率和妊娠率有逐漸降低，自然流產(chǎn)率升高趨勢(shì)，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：控制性超排卵中，hCG注射日孕酮水平對(duì)著床率，臨床妊娠率，自然流產(chǎn)率無(wú)顯著影響。 第二部分生長(zhǎng)激素在COH中對(duì)卵巢反應(yīng)低下患者的應(yīng)用價(jià)值及可能機(jī)制的初步研究 在控制性超排卵中，卵巢反應(yīng)低下是困擾輔助生殖臨床醫(yī)生的一大難題之一，也是COH周期取消的常見原因。人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到促性腺激素并非是卵巢功能的唯一調(diào)節(jié)因子，生長(zhǎng)激素及各

8、種多肽生長(zhǎng)因子對(duì)卵巢和卵泡發(fā)育也具有重要的意義。本部分的研究工作是探討生長(zhǎng)激素對(duì)控制性超排卵中卵巢反應(yīng)低下的患者的應(yīng)用價(jià)值。將38名符合卵巢反應(yīng)低下的不孕癥患者，隨機(jī)分為生長(zhǎng)激素組(21名)和對(duì)照組(17名)，均采用短方案降調(diào)節(jié)，其中生長(zhǎng)激素組從周期第2-3天每天注射4IU生長(zhǎng)激素，比較兩組超排卵過(guò)程及結(jié)局。 結(jié)果：兩組間病人的年齡、不孕原因和不孕年限均無(wú)明顯差異；兩組病人超排過(guò)程中的各項(xiàng)參數(shù)，包括各時(shí)期內(nèi)分泌結(jié)果，促性腺激素的

9、使用時(shí)間，劑量，獲卵數(shù)，受精率，卵裂率，優(yōu)質(zhì)胚胎率，移植胚胎數(shù)目均無(wú)顯著性差異，最終 GH 組獲得了42.1％的臨床妊娠率，而對(duì)照組僅為13.3％，GH 組有一例患者為宮外妊娠，其余均在繼續(xù)妊娠中。兩組病人中，超排周期第二天血清GH、抑制素、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFBP3 水平均無(wú)顯著差異；超排周期第六天兩組病人的抑制素水平無(wú)顯著差異；注射HCG 日中，GH組血清IGF-Ⅰ水平較對(duì)照組顯著增加(P<0.000)；IGF-Ⅱ水平在兩

10、組間無(wú)顯著差異；GH組血清IGFBP3 水平較對(duì)照組顯著下降(P<0.000)；兩組病人卵泡液中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFBP3水平均無(wú)顯著差異。 本研究對(duì)GH提高臨床妊娠率進(jìn)行了初步探討。我們通過(guò)建立了卵巢黃素化顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，并向培養(yǎng)體系中添加不同濃度的GH和/或FSH，探討生長(zhǎng)激素在體外對(duì)顆粒細(xì)胞的分泌類固醇激素(E2和P)的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而為進(jìn)一步探討其對(duì)卵泡發(fā)育的影響打下基礎(chǔ)。 結(jié)果：隨著GH濃度的增

11、加，培養(yǎng)液中E2水平不斷增加，當(dāng)GH濃度為500ng/ml時(shí)，與空白對(duì)照組比較，E2水平有顯著差異性(P<0.05)；當(dāng)GH濃度為1000ng/ml時(shí)，與空白對(duì)照組比較，E2水平也有顯著差異性(P<0.05)：而各組培養(yǎng)液中P水平無(wú)顯著差異：在相同濃度的FSH作用下隨著GH濃度的增加，培養(yǎng)液中E2水平不斷增加；在相同濃度GH作用下，隨著FSH濃度的增加，培養(yǎng)液中E2水平不斷增加，其中當(dāng)FSH濃度在1000ng/ml時(shí)，分別與相同GH濃度

12、的FSH空白組比較。E2水平差異具有顯著性(P<0.05)；而各組間P水平無(wú)顯著差異。 然后收集經(jīng)過(guò)GH(500ng/ml)作用后的人卵巢顆粒細(xì)胞和空白對(duì)照組顆粒細(xì)胞為材料，應(yīng)用以SMART(Switching Mechanism At 5′endof the RNA Transcript)技術(shù)為基礎(chǔ)的抑制性消減雜交技術(shù)(SuppressionSubtractive Hybridization，SSH)，以GH作用后的顆粒細(xì)胞為

13、檢測(cè)子(tester)，以對(duì)照組顆粒細(xì)胞為驅(qū)趕子(driver)，獲得了GH作用后差異表達(dá)的cDNA產(chǎn)物。G3PDH基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)顯示消減效率達(dá)10個(gè)循環(huán)左右(約1000倍)。進(jìn)一步將cDNA產(chǎn)物克隆入pUCm-T載體，通過(guò)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)和PCR檢測(cè)，篩選出在人卵巢顆粒細(xì)胞中，GH作用前后差異表達(dá)的克隆。反向斑點(diǎn)雜交結(jié)果顯示大部分克隆在GH作用前后的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)有差異。選取其中60個(gè)與GenBank比較，顯示其中52個(gè)EST代表23個(gè)已知