IL23R、PTPN2、10q21基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關性的初步研究.pdf

1、背景、目的 炎癥性腸病(Inflammatoryboweldisease，IBD)包括克羅恩病(Crohn'sdisease，CD)和潰瘍性結腸炎(Ulcerativecolitis，UC)。近年來IBD的發(fā)病率呈上升趨勢，特別是CD的發(fā)病率，隨著雙氣囊小腸鏡的應用，CD的發(fā)現(xiàn)率逐年上升。以往IBD一直被認為是一種自身免疫性疾病，而近年來多個研究證明IBD特別是CD具有明顯的遺傳易感性。目前較為一致的觀點認為，炎癥性腸病是攜帶遺

2、傳易感基因的宿主在環(huán)境因素作用下，自身免疫功能紊亂導致的一種非特異性炎癥性疾病。因此遺傳因素在炎癥性腸病的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。隨著人類基因組計劃的完成，對基因研究的重點已由全基因組序列測定轉移到了對基因組中個體基因多態(tài)性和功能的研究。個體基因多態(tài)性的主要形式就是單鏈核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)，SNP被公認為繼“限制性片段長度多態(tài)性”和“微衛(wèi)星多態(tài)性”這兩種遺傳標記之后，出現(xiàn)

3、的“第三代DNA遺傳標記”，是目前全世界基因研究領域的熱點之一。 2001年歐洲Hugot研究小組及美國Ogura研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)了人類第一個CD易感基因NOD2基因，后改名為CARD15，并證實該基因的3個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點Arg702tRP、Gly908Arg和Leu1007fsinsC是白種人CD的易感基因，但后來的研究證明此三個SNP位點與日本人及我國香港人、浙江人CD患者無關。我們也對廣東地區(qū)CD患者NO

4、D2基因的三個SNP位點進行研究發(fā)現(xiàn)其與CD無顯著相關，并通過基因測序的方法發(fā)現(xiàn)了可能與中國人CD密切相關的SNP位點P268S，并成功構建了該位點的突變型真核表達載體，為后續(xù)功能的研究打下了基礎。最近西方多個研究小組通過全基因掃描的方法分別對歐洲高加索人、猶太人、英國、法國、巴爾干、德國、加拿大(魁北克)等地區(qū)的IBD患者進行研究，發(fā)現(xiàn)了一些與IBD，特別是CD患者密切相關的SNP位點，主要位于IL23R、ATG16L1、PTPN2、

5、10q21、NKX2、IRGM、MST1、DLG5、OCTN1、5p31等基因中。其中位于IL23R基因中的rs11209026、rs11805303位點、PTPN2基因中的rs2542151和位于染色體10q21中的rs10761659SNP位點統(tǒng)計學意義較為明顯；rs11209026位于IL23R基因的第10外顯子中，正常為G，突變?yōu)锳，導致381位的氨基酸由精氨酸(Arg)變?yōu)楣劝滨０?Gin)，Duerr等人研究的結果認為該SN

6、P位點與歐洲白種人CD患者顯著相關(P=1.56×10-3)，其OR值為0.26(猶太人為0.47)；rs11805303位于IL23R基因第7和第8外顯子之間的內含子之中，正常為C，突變?yōu)門，該堿基的改變增加了西方人CD發(fā)病的風險，雜合突變的OR值為1.39，純合突變的OR值為1.86；rs2542151位于PTPN2基因上游約5.5kb的區(qū)域中，可能為PTPN2基因的啟動子區(qū)或者上游控制元件，PTPN2基因編碼一種關鍵的炎癥負性調節(jié)

7、因子-T細胞蛋白酪氨酸磷酸酶(Tcellproteintyrosinephosphatase，TCPTP)，在西方IBD患者當中，其危險等位基因為G，雜合子的OR值為1.3(1.14-1.48)，純合子的OR值為2.01(1.46-2.76)，rs10761659位于10q21的基因間區(qū)，其危險等位基因為G，其雜合子的OR值為1.23(1.05-1.45)，純合子的OR值為1.55(1.30-1.84)。 本研究的目的通過基因測

8、序和限制性片段長度多態(tài)性的方法探索與西方白種人及猶太人CD患者密切相關的上述四個多態(tài)性位點與IBD患者發(fā)病易感性的相關性，及其與臨床特征的關系，為進一步研究IBD的發(fā)病機制及探索IBD易感基因打下基礎，并有可能為臨床治療IBD提供一種新的基因治療靶點。 材料和方法： 1、收集南方醫(yī)院消化科及普外科確診，臨床資料完整，彼此無血源關系的廣東及外省籍CD患者40例(包括前期收集病例24例和新收病例16例)，UC患者40例(所選

9、患者均為手術或者內鏡下確診的病例，并除外合并其它自身免疫性疾病)，所選患者中男52例，女28例；平均年齡34歲；健康對照組(Healthycontrol，HC)取門診健康體檢者50例，其中男32例，女18例，平均年齡35歲；所有研究對象均抽取外周血5ml。 2、應用特異性結合DNA的硅基質材料離心吸附柱法和獨特的洗脫緩沖液系統(tǒng)抽提血液基因組DNA(按試劑盒說明書操作)，抽提成功后DNA產物-70℃保存。 3、針對上述四個

10、SNP位點用Primer5.0軟件設計PCR引物，PCR方法擴增包含這四個SNP位點在內的DNA片段，擴增產物以1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察以確保目的片段擴增成功，然后采用切膠純化試劑盒(TIANGEN公司提供)將目的片段純化回收，分光光度計檢測純化產物濃度。 4、將純化產物分別采用DNA直接測序法和聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphismpolymeras

11、echainreactionproducts，PCR-RFLP)進行研究；測序結果用chromas231判讀SNP位點的基因型。酶切產物以2.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果判讀SNP位點的基因型。采用基因計數(shù)法計算四個SNP位點基因型頻率和等位基因頻率，最后進行統(tǒng)計分析。 結果： 1、IL23R(rs11209026和rs11805303)基因多態(tài)性與炎癥性腸病發(fā)病的相關性： 通過DNA測序，我們發(fā)現(xiàn)中國人部分

12、CD患者位于IL23R中的這兩個SNP位點基因型頻率及等位基因頻率與健康對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；rs11805303位點基因型頻率UC組與HC組比較，P>0.05，差異無顯著性；而等位基因頻率比較，P<0.05(Fisher精確概率檢驗P=0.024)，差異具有統(tǒng)計學意義；但rs11805303位點基因多態(tài)性與中國部分UC患者的性別、疾病的活動性及發(fā)病部位比較P值均大于0.05；提示rs11805303位點的多態(tài)性

13、可能與中國部分UC患者有相關性。 2、PTPN2(r$2542151)和10q21(rsl0761659)基因多態(tài)性與炎癥性腸病發(fā)病的相關性： 通過聚合酶鏈反應一限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)，結果顯示：①PTPN2(rs2542151)位點：CD組基因型頻率、等位基因頻率和基因攜帶者頻率分別與HC組比較P值均大于0.05，而UC組基因型頻率和等位基因頻率與HC比較P<0.05(分別為：0.002和0.00

14、6)，且3例純合子GG均出現(xiàn)于UC患者，提示該位點可能與中國部分UC患者的發(fā)病易感性有關。②10q21(rs10761659)位點：UC組的基因型頻率、等位基因頻率和基因攜帶者頻率分別與HC組比較P值均大于0.05，CD組等位基因頻率與HC組比較P值也大于0.05，而基因型頻率與HC組比較P=0.044，提示該位點可能與中國UC患者易感性無關，但該位點基因型可能與中國部分CD患者有相關性。但這兩個位點與相應疾病的臨床特征均無顯著相關(P

15、值均大于0.05)。 結論： 1、IL23R中兩個與西方人CD密切相關的SNP位點(rs11209026和rs11805303)的基因多態(tài)性與中國部分CD患者的發(fā)病無顯著相關性，而rs11805303位點的多態(tài)性可能與中國部分UC患者有相關性，且該堿基的改變降低了UC的發(fā)病風險，但這個SNP位點基因多態(tài)性與UC患者的病變特點并無顯著相關； 2、位于PTPN2基因上游區(qū)域中的rs2542151位點可能是中國部分UC