核因子-κB亞基p50和p65對永生化神經(jīng)前體細(xì)胞存活的影響及機(jī)制研究.pdf

1、課題一：研究背景和目的：
　　 缺血缺氧性腦損傷是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見疾病之一，其導(dǎo)致神經(jīng)組織缺失，傳統(tǒng)的藥物治療療效難以令人滿意。神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為組織再生修復(fù)帶來了希望。神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞是一類具有自我更新能力、增殖能力和多向分化潛能的未成熟細(xì)胞。它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、正常腦功能的維護(hù)和腦損傷的修復(fù)中發(fā)揮了重要的作用。但是研究發(fā)現(xiàn)，由于局部缺血缺氧性微環(huán)境的改變，內(nèi)源性遷移或外源性移植的神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞存活

2、數(shù)量少、存活時間短，難以發(fā)揮有效的修復(fù)作用。核因子-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控一系列基因的表達(dá)。它由5種亞基組成，p65和p50是其中最重要的兩個亞基。NF-κB在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，在缺血狀態(tài)下，缺血灶周圍組織中NF-κB被激活，但其發(fā)揮保護(hù)作用還是促凋亡作用，目前尚存爭議。以上這些現(xiàn)象使我們關(guān)注到這樣一個問題，缺血灶周圍NF-κB激活對神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的存活有無影響？干預(yù)NF-κB能否成為改善神經(jīng)前體細(xì)胞腦損傷修復(fù)作用的新策略

3、？
　　 本課題擬以永生化神經(jīng)前體細(xì)胞株為細(xì)胞模型，通過NF-κB亞基p50、p65基因轉(zhuǎn)染探討其對神經(jīng)前體細(xì)胞存活的影響及其機(jī)制，進(jìn)而明確NF-κB在神經(jīng)發(fā)生學(xué)和缺血缺氧性神經(jīng)前體細(xì)胞損傷中的作用，為進(jìn)一步探討神經(jīng)前體細(xì)胞修復(fù)治療缺血性腦損傷奠定理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1．介導(dǎo)外源基因?qū)胗郎窠?jīng)前體細(xì)胞株非病毒載體的選擇用非病毒載體陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，TRANSfe

4、ction 或陽離子聚合物Sofast分別負(fù)載質(zhì)粒EGFP-C1轉(zhuǎn)染INPC，轉(zhuǎn)染后24 h檢測轉(zhuǎn)染效率。對轉(zhuǎn)染效率最高的一種載體，觀察其轉(zhuǎn)染后12、24、48和72 h的轉(zhuǎn)染效率，確定EGFP表達(dá)最高峰。用臺盼藍(lán)排斥試驗檢測轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力。質(zhì)粒EGFP-C1轉(zhuǎn)染INPC后，經(jīng)新霉素類似物G418篩選，挑選穩(wěn)定細(xì)胞克隆INPC/EGFP，并觀察其EGFP陽性率。應(yīng)用巢蛋白抗體鑒定INPC/EGFP。胎牛血清誘導(dǎo)INPC/EGFP

5、分化，觀察分化后細(xì)胞的形態(tài)及EGFP表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)RcCMV-p65質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染INPC后p65的表達(dá)。
　　 2．NF-κB亞基p50、p65基因修飾的永生化神經(jīng)前體細(xì)胞株的構(gòu)建采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 將p50和p65編碼質(zhì)粒RcCMV-p50、RcCMV-p65和對照空質(zhì)粒Rc/CMV分別轉(zhuǎn)染永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株。經(jīng)G418篩選，挑選陽性克隆。

6、采用有限稀釋法分離單細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫印跡法挑選p50或p65表達(dá)量最高的單細(xì)胞克隆。瞬時轉(zhuǎn)染RcCMV-p50質(zhì)粒于已挑選出的p65表達(dá)量最高的單細(xì)胞克隆。RT-PCR檢測新霉素基因、p50或p65基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。免疫印跡法檢測p50或p65基因蛋白的表達(dá)。
　　 3．轉(zhuǎn)染NF-κB亞基后不同二聚體的形成、分布及轉(zhuǎn)錄活性將NF-κB亞基p50、p65基因修飾后的不同永生化神經(jīng)前體細(xì)胞株進(jìn)行凝膠電泳遷

7、移實驗檢測胞核內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性。免疫印跡分析胞漿NF-κB抑制蛋白的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測p50和p65分別在細(xì)胞中的含量及胞漿胞核的分布。運用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測各細(xì)胞株NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。
　　 4．NF-κB對永生化神經(jīng)前體細(xì)胞株存活的影響及相關(guān)作用機(jī)理在正常及缺氧缺糖1 h或3 h條件下，熒光素酶報告系統(tǒng)檢測各細(xì)胞株的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，Annexin V和碘化丙錠雙標(biāo)記法流式細(xì)胞儀檢測各細(xì)胞株凋亡率。缺氧

8、缺糖6 h后，雙苯甲亞胺Hoechst 33342 染細(xì)胞核，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。缺氧缺糖12h后，四甲基偶氮唑鹽比色試驗測定細(xì)胞存活率。在正常及缺氧缺糖6 h條件下，免疫印跡分析各細(xì)胞株NF-κB凋亡相關(guān)靶基因Bcl-2，Bax，Bcl-Xs/l，F(xiàn)AS-L，p53，XIAP和Actin蛋白的表達(dá)，通過Amersham 公司ImageQuant TL軟件分析條帶的光密度值，計算各細(xì)胞株Bax/Bcl-

9、2比值。
　　 5．統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間多個樣本均數(shù)的比較采用重復(fù)測量的雙因素方差分析或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 1．Lipofectamine 2000，TRANSfection和Sofast轉(zhuǎn)染INPC后24h，其分化后呈神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞樣，且胞體及突起中仍可見綠色熒光。Lipofectam

10、ine 2000介導(dǎo)RcCMV-p65質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染后，部分細(xì)胞呈p65陽性染色，陽性率約為15％。
　　 2．通過穩(wěn)定篩選和有限稀釋法分離得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p65的單細(xì)胞克隆A12、A13、B11、C21、C22和E2。其p65免疫染色和免疫印跡分析均呈陽性,但C21的p65表達(dá)強(qiáng)于其它克隆。將C21克隆命名為INPC/p65細(xì)胞株，進(jìn)行后續(xù)實驗，并再次瞬時轉(zhuǎn)染RcCMV-p50質(zhì)粒，獲得INPC/p50p65細(xì)胞株。同樣得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)

11、染RcCMV-p50、RcCMV質(zhì)粒的單細(xì)胞克隆，分別命名為INPC/p50和INPC/CMV細(xì)胞株。Neo基因RT-PCR顯示，對照空質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染至INPC/CMV。RT-PCR和免疫印跡分析顯示，p50和p65基因均能在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒的細(xì)胞株中高效表達(dá)。
　　 3．EMSA表明，INPC/p50、INPC/p65和INPC/p50p65細(xì)胞胞核中分別形成p50同源二聚體、p65同源二聚體、p50p65異源二聚體和p50同

12、源二聚體。INPC/p65和INPC/p50p65細(xì)胞株中，IκBα在胞漿中表達(dá)升高。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示INPC/p50細(xì)胞株中主要為強(qiáng)的胞核p50陽性染色，然而INPC/p65細(xì)胞株中主要為胞漿p65陽性染色，但在一些細(xì)胞中也可見胞核p65陽性染色。NF-κB轉(zhuǎn)錄活性在INPC/p50細(xì)胞株中輕度增高，在INPC/p65、INPC/p50p65細(xì)胞株中明顯的升高，其中以INPC/p65細(xì)胞株最高。
　　 4．κB依賴性的熒光素酶

13、活性在不同的NF-κB亞基轉(zhuǎn)染細(xì)胞株間及不同的缺氧缺糖處理組間有顯著性差異。Annexin V-FITC凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，INPC/p65和INPC/p50p65細(xì)胞株發(fā)生了自發(fā)性的細(xì)胞凋亡，而且對缺氧缺糖刺激更為敏感。缺氧缺糖6 h后，各細(xì)胞株可觀察到凋亡形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測證實INPC/p65和INPC/p50p65細(xì)胞株的凋亡率升高，并且缺氧缺糖12 h后，細(xì)胞存活率低于其它細(xì)胞株。在正常及缺氧缺糖處理6 h條件下，Bax和Bc

14、l-2蛋白的表達(dá)及兩者的比值在INPC/p65和INPC/p50p65細(xì)胞株中升高。
　　 研究結(jié)論：
　　 1．Lipofectamine 2000可高效簡便地轉(zhuǎn)染INPC。這為探討轉(zhuǎn)NF-κB基因?qū)τ郎窠?jīng)前體細(xì)胞的生物學(xué)特性影響奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　 2．成功構(gòu)建了NF-κB亞基p50、p65基因修飾的永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株。
　　 3．P50、p65的高表達(dá)可逃逸胞漿內(nèi)內(nèi)源性IκBα的阻滯作用

15、，導(dǎo)致胞核內(nèi)形成不同的NF-κB二聚體，并可直接升高NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。
　　 4．轉(zhuǎn)染NF-κB不同亞基后升高的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性凋亡，并對凋亡性刺激更加敏感，而這一現(xiàn)象可能通過Bcl-2家族依賴性途徑介導(dǎo)。
　　 研究總結(jié)：
　　 本課題通過脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了NF-κB亞基p50、p65基因修飾的永生化神經(jīng)前體細(xì)胞株，并證實p50、p65的高表達(dá)可逃逸胞漿內(nèi)內(nèi)源性IκBα的阻滯

16、作用，導(dǎo)致胞核內(nèi)形成不同的NF-κB二聚體，并直接升高NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，上述研究有助于我們明確NF-κB在神經(jīng)發(fā)生學(xué)和缺血缺氧性神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞損傷中的作用，抑制NF-κB活性可能成為改善神經(jīng)前體細(xì)胞腦損傷修復(fù)作用的新策略。
　　 課題二：
　　 目的：研究人胚不同胚齡或腦區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞體外培養(yǎng)及增殖分化特性。
　　 方法：取人胚腦組織原代細(xì)胞分為小胚齡全腦組、較大胚齡全腦組、較大胚齡新皮質(zhì)組、較大胚齡紋狀

17、體組、較大胚齡間腦組、較大胚齡中腦組、較大胚齡后腦組和較大胚齡延髓組8組，懸浮培養(yǎng)。鑒定細(xì)胞球巢蛋白抗原的表達(dá),分化及自我更新能力。觀察各組培養(yǎng)細(xì)胞的生長、增殖狀況。運用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法比較小胚齡全腦組、較大胚齡全腦組、較大胚齡新皮質(zhì)組、較大胚齡紋狀體組及較大胚齡間腦組神經(jīng)球分化后，神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例。
　　 結(jié)果：各組培養(yǎng)出的懸浮細(xì)胞球巢蛋白抗原陽性，可分化為微管相關(guān)蛋白2或膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性細(xì)胞，且5-溴-2-脫

18、氧尿苷摻入實驗陽性。培養(yǎng)一周，較大胚齡紋狀體組的神經(jīng)球數(shù)目最多，形態(tài)最規(guī)則，其次分別為較大胚齡間腦組、小胚齡全腦組、較大胚齡全腦組、較大胚齡新皮質(zhì)組，其它組僅見個別神經(jīng)球。采用有限稀釋法可從較大胚齡紋狀體組挑選單細(xì)胞克隆球。
　　 結(jié)論：從不同胚齡和腦區(qū)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源的人神經(jīng)前體細(xì)胞均能在體外擴(kuò)增，針對不同胚齡可采用不同的原代取材方法，小胚齡可取全腦組織培養(yǎng)，而大胚齡則可取紋狀體等特定腦區(qū)進(jìn)行培養(yǎng)。不同胚齡或腦區(qū)來源的NPC