谷氨酰胺對人肺腺癌A549細胞增殖、遷移及TNF--α和NF--κB p65表達的影響.pdf

1、目的：通過體外細胞實驗研究谷氨酰胺(Glutamine，Gln)對人肺腺癌細胞株A549增殖、遷移能力以及TNF-α和NF-κB p65表達的影響，探討谷氨酰胺對人肺腺癌細胞株A549的增殖抑制作用及其可能機制。
　　方法：(1)人肺腺癌A549細胞的培養(yǎng)：以含10％胎牛血清（不含谷氨酰胺）的DMEM培養(yǎng)基，置于飽和濕度、CO2濃度為5％、溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)取處于對數(shù)生長期的A549細胞傳代3～4次后，用于后續(xù)

2、實驗。實驗共分7組：空白對照組（無藥物干預）;按谷氨酰胺濃度梯度分為6個實驗組：2mmol/L;4mmol/L;8mmol/L;16mmol/L;32mmol/L;64mmol/L。各組按谷氨酰胺干預時間分為：24h組;48h組;72h組。實驗結(jié)束后收集每組細胞，利用CCK-8法檢測各組的吸光度值（OD值），并計算各組細胞增殖抑制率，比較各組之間的差異;篩選出適宜抑制濃度用于后續(xù)實驗。(3)取對數(shù)生長期的人肺腺癌A549細胞接種于Tra

3、nswell小室，再給予篩選出的適宜谷氨酰胺濃度干預48小時，于5％CO2、37℃恒溫孵育箱進行培養(yǎng)。實驗結(jié)束后染色并于顯微鏡下觀察和拍照，計數(shù)穿膜細胞數(shù)量，評估A549細胞遷移能力。(4)取對數(shù)生長期的人肺腺癌A549細胞接種于96孔板，按篩選出的谷氨酰胺濃度干預實驗組細胞72小時，實驗結(jié)束后收集各組細胞上清液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定各組細胞中TNF-α的表達水平，比較各組之間TNF-α表達的差異。(5)取對數(shù)生長期的人

4、肺腺癌A549細胞實驗，按篩選出的谷氨酰胺濃度干預實驗組細胞72小時，實驗結(jié)束后提取細胞總蛋白，用蛋白免疫印跡雜交法(Western Blot)測定各組細胞中NF-κB p65蛋白的表達，比較各組之間NF-κB p65表達的差異。
　　結(jié)果：(1)CCK-8結(jié)果顯示：Gln對人肺腺癌A549細胞的作用與干預濃度有關(guān)。低濃度Gln(2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L)干預組對A549細胞增殖無明顯抑制作用;與對照組相比，

5、高濃度Gln(16mmol/L、32mmol/L、64mmol/L)干預組對A549細胞增殖有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，并且隨干預時間的延長，增殖抑制作用增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);同一時間點32mmol/L組和64mmol/L組對A549細胞的增殖抑制作用無明顯差別，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2)Transwell遷移實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，Gln(32mmol/L)干預組的遷移細胞數(shù)量

6、明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。(3)ELISA結(jié)果顯示：與對照組相比，不同濃度(16mmol/L、32mmol/L、64mmol/L)的Gln干預人肺腺癌A549細胞株后，對A549細胞中TNF-α表達均有抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但32mmol/L組和64mmol/L組之間TNF-α的表達水平無明顯差異，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(4)Western Blot結(jié)果顯示：與對照組相比，不同濃度

7、(16mmol/L、32mmol/L、64mmol/L)的Gln干預人肺腺癌A549細胞株后，對A549細胞NF-κB p65的表達均有抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但32mmol/L組和64mmol/L組之間NF-κB p65蛋白的表達水平無明顯差異，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：(1)谷氨酰胺可以抑制人肺腺癌A549細胞增殖，32mmol/L可能為最適抑制濃度。(2)谷氨酰胺可以抑制人肺腺癌A549細