核因子-κB亞單位p65短發(fā)夾狀干擾RNA對(duì)肝星狀細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、慢性肝臟疾病是一類世界性的嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病，其中肝纖維化是這個(gè)過程的中間及關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是啟動(dòng)整個(gè)事件的開端，在肝纖維化過程中扮演著重要的角色，誘導(dǎo)活化HSC的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。越來越多的研究認(rèn)為HSC活化和增殖與其凋亡受到抑制有關(guān)，而核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕

2、鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的蛋白因子，由Rel蛋白家族的成員以同源或異源二聚體形式組成，目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物的Rel蛋白包括p65(RelA，NF-κB3)、p50(NF-κB1)、Rel(c-Rel)、RelB和p52(NF-κB2)，其中p65/p50是發(fā)現(xiàn)最早的，分布最廣泛，主要發(fā)揮生理作用的NF-kB。NF-κB能與多種細(xì)胞基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和

3、凋亡等重要的病理生理過程密切相關(guān)。近年RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)為抑制NF-κB的基因表達(dá)開辟了新的途徑。RNA干擾是指將與內(nèi)源性mRNA互補(bǔ)的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞后，引起該mRNA特異性降解，導(dǎo)致mRNA編碼的基因不能表達(dá)，發(fā)生基因沉默，提示我們可以通過RNA干擾技術(shù)沉默NF-κB的基因表達(dá)，從而使HSC的凋亡增加，減緩肝纖維化的進(jìn)程。 目的：本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)短發(fā)夾狀干擾RNA(short

4、hairpinRNA，shRNA)對(duì)NF-κBp65進(jìn)行基因干擾，研究其對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活的肝星狀細(xì)胞凋亡的影響。 方法：體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞，進(jìn)行以下分組：①空白對(duì)照組；②LPS組：經(jīng)LPS處理；③陰性組：經(jīng)陰性干擾RNA與LPS處理；④陽性組：經(jīng)NF-κBp65 shRNA與LPS處理；⑤脂質(zhì)體2000組：經(jīng)脂質(zhì)體2000與LPS處理。應(yīng)用western blot檢測(cè)其NF-κBp

5、65、p50及IκBa的蛋白表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chainreaction,RT-PCR)檢測(cè)NF-κBp65與I型前膠原mRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)、末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

6、的變化，酶譜法測(cè)定明膠酶活性。 結(jié)果： 1.siRNA轉(zhuǎn)染HSC的效率： 將熒光素標(biāo)記的對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染HSC，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示33nmol/LsiRNA組轉(zhuǎn)染72小時(shí)效率最高，可達(dá)90％以上。 2.LPS激活HSC后細(xì)胞核中NF-κBp65蛋白的表達(dá)： western blot結(jié)果顯示同一濃度的LPS激活HSC后，HSC細(xì)胞核中NF-κBp65蛋白表達(dá)增加，于1小時(shí)細(xì)胞核中

7、NF-κBp65蛋白表達(dá)最高，并且濃度為1000ng/mlLPS激活HSC1小時(shí)后表達(dá)NF-κBp65蛋白增加(232.15％±5.28％)比100ng/mlLPS激活HSC后表達(dá)NF-κBp65蛋白增加(168.18％±3.39％)明顯。 3.NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后細(xì)胞核中NF-kBp65蛋白及mRNA的表達(dá)減低： western blot結(jié)果顯示陽性組HSC細(xì)胞核中NF-κBp65蛋

8、白的表達(dá)減低，24小時(shí)比LPS組減低72.41％±1.22％，48小時(shí)減低77.45％±1.23％，72小時(shí)減低86.34％±41.01％，于72小時(shí)減低最高，而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無明顯減低。RT-PCR結(jié)果顯示，陽性組NF-κBp65 mRNA表達(dá)明顯減低，而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無明顯減低。此結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了針對(duì)大鼠HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543-1561的陽性shRNA，將其

9、轉(zhuǎn)染HSC有效地干擾了NF-κBp65的mRNA及蛋白發(fā)達(dá)，并于72小時(shí)干擾效率達(dá)到最高。 4 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC72小時(shí)后NF-κBp50和IκBa蛋白表達(dá)減低： western blot結(jié)果顯示經(jīng)陽性組HSC細(xì)胞核中NF-κBp50蛋白的表達(dá)減低，LLLPS組減低75.45％±0.93％，而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無明顯減低。陽性組細(xì)胞漿中IκcBa蛋白減低，比LPS

10、組減低70.61％±42.19％，而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無明顯減低，說明NF-κBp65 shRNA轉(zhuǎn)染HSC后，干擾NF-κBp65的mRNA及蛋白發(fā)達(dá)的同時(shí)，NF-κBp50及IκBa蛋白表達(dá)隨之降低。 5 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后HSC凋亡增加： 流式細(xì)胞法結(jié)果顯示陽性組細(xì)胞凋亡較LPS組增加，凋亡率為15.40％±40.72％，而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組

11、比較無明顯增加。TUNEL法結(jié)果顯示經(jīng)陽性組HSC凋亡較LPS組增加，凋亡率為33.33％±1.06％，而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無明顯增加。 6 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)減低： RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)陽性組Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)明顯減低，較LPS組減低56.84％±1.89％，而陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPSS組比較無明顯減低，表明經(jīng)NF-κBp65 sh

12、RNA基因干擾后Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)減低。 7 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后明膠酶活性增高： 酶譜法測(cè)定結(jié)果顯示，陽性組明膠酶活性明顯升高，陰性組及脂質(zhì)體2000組與LPS組比較無明顯變化。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了針對(duì)HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543-1561的陽性shRNA，將其轉(zhuǎn)染HSC，有效地干擾了NF-κBp65的基因發(fā)達(dá)，與此同時(shí)，NF-κB p5