血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2在自發(fā)性高血壓大鼠中的表達(dá)及其受依那普利的影響.pdf

1、目的: （1）觀察自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensiverat，SHR）和其對(duì)照組WKY大鼠（wistar—kyoto rat）的血壓、體重以及心室重構(gòu)的差別，以探討SHR的病理生理特點(diǎn)。 （2）觀察依那普利對(duì)SHR血壓、心室重構(gòu)的影響。 （3）觀察SHR和WKY大鼠心臟的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin—convertingenzyme，ACE）和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（AC

2、E2）的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的差別，探討ACE和ACE2在SHR高血壓發(fā)生發(fā)展當(dāng)中的作用。 （4）觀察依那普利對(duì)SHR心臟ACE和ACE2的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，探討ACE及ACE2在依那普利降壓機(jī)制中的作用。 方法: （1）SHR的分組及藥物干預(yù)：將15只SHR隨機(jī)分為2組：SHR對(duì)照組（n=7）和依那普利組（n=8），分別給以安慰劑、依那普利15mg.kg—1.d—1灌胃干預(yù)4周，干預(yù)過程中每周測(cè)量體重

3、并根據(jù)體重調(diào)整給藥量。同時(shí)取10只WKY大鼠作為正常血壓對(duì)照組。 （2）血壓的測(cè)量：用無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓代表收縮壓水平。干預(yù)過程中每周測(cè)量一次，方法為尾套間接測(cè)量法。 （3）大鼠的處死及標(biāo)本的采取：干預(yù)結(jié)束后腹腔注射戊巴比妥鈉以麻醉大鼠，剪開胸腔，取出心臟，分離左心室。剪下小塊左心室組織，用福爾馬林浸泡，以備免疫組化使用。剩余組織凍存于液氮中，以用作逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription—polyme

4、rase chain reaction，RT—PCR）和western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)。 （4）左心室重量（left ventricular mass，LVM）及左心室重量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）：兩項(xiàng)指標(biāo)可反應(yīng)左室重構(gòu)的情況。LVMI是左心室的重量與體重的比值。大鼠處死前稱量其體重，處死后分離左心室，精確測(cè)量LVM，然后計(jì)算出LVM與體重的比值（mg/g）即得LVMI

5、。 （5）心肌組織ACE及ACE2的mRNA的RT—PCR檢測(cè)：用Trizol提取標(biāo)本的總RNA，測(cè)定總RNA濃度。所有標(biāo)本取4μg的總RNA作為模板逆轉(zhuǎn)錄cDNA，然后用3μl cDNA產(chǎn)物做ACE、ACE2及參照基因延長(zhǎng)因子1α（elongation factor1α，EF1α）的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后測(cè)定電泳條帶的光密度（optical density，OD）值，用目的基因和EF1α基因的OD

6、值的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。 （6）心肌組織ACE及ACE2的western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)：取少量心肌組織，置于預(yù)先加有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，剪碎，勻漿，提取膜蛋白。用考馬斯亮蘭法測(cè)定總蛋白濃度。每個(gè)標(biāo)本取含有10μg總蛋白的裂解勻漿產(chǎn)物進(jìn)行十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行ACE、ACE2及參照蛋白β—actin的western blot免疫印跡，

7、然后對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，X光片顯影，對(duì)X光片中的目的蛋白及β—actin的條帶進(jìn)行灰度分析，用目的蛋白和β—actin的灰度值的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。 （7）心肌組織ACE及ACE2的免疫組織化學(xué)染色：染色方法為鏈霉親合素—生物素復(fù)合物（streptavidin—biotin complex，SABC）法。石蠟切片在二甲苯及降序梯度酒精溶液中常規(guī)脫蠟至水，過氧化氫（H2O2）滅活內(nèi)源性酶，然后用兔血清封閉液封閉

8、，加一抗，生物素化二抗及SABC，之后用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobezidin，DAB）顯色劑顯色。然后升序梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。 （8）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。三組及三組以上比較用方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。 結(jié)果： （1）SHR和WKY大鼠體重和血壓的比較：16周齡時(shí)SHR組的體重低于

9、WKY組（380±23g vs339±21g，P<0.05），但血壓顯著高于WKY組（191±19 mmHgvs122±14mmHg，P<0.01）。20周齡時(shí)SHR組體重仍然低于WKY組（415±25g vs376±20g，P<0.01），血壓也依然明顯高于WKY組（187±11 mmHg vs116±4mmHg，P<0.01）。 （2）SHR的心室重構(gòu)及受依那普利的影響：SHR對(duì)照組的LVM和LVMI皆顯著高于WKY組（11

10、02±81 mg vs782±24 mg，P<0.01；2.96±0.17mg/g vs1.88±0.12mg/g，P<0.01）。依那普利組的LVM和LVMI都明顯低于SHR對(duì)照組（906±128mgvs1102±81 mg，P<0.01；2.43±0.29 mg/g vs2.96±0.17 mg/g，P<0.01），但二者都仍大于WKY組（906±128mg vs782±24mg，P<0.05；2.43±0.29 mg/g vs1.

11、88±0.12 mg/g，P<0.01）。心肌組織的HE染色顯示，SHR對(duì)照組心肌纖維較WKY組心肌纖維明顯肥大，而依那普利組的心肌纖維較SHR對(duì)照組明顯纖細(xì)，較為接近WKY組。 （3）16—20周齡間，SHR對(duì)照組、WKY組和依那普利組血壓的演變：SHR對(duì)照組在16—20周齡間的五次血壓依次為188±24mmHg、187±17 mmHg、189±18mmHg、185±15 mmHg、187±11 mmHg，方差分析顯示無明顯變

12、化（P>0.05）。WKY組大鼠的五次血壓依次為122±14 mmHg、124±10 mmHg、118±13 mmHg、120±15mmHg、116±4 mmHg，亦無顯著變化（P>0.05）。 （5）依那普利對(duì)SHR心臟ACE和ACE2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的干預(yù)：干預(yù)后依那普利組ACE的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯低于SHR對(duì)照組（ACE/EF1α：0.44±0.19 vs1.68±0.34，P<0.01；ACE/β—acti

13、n：0.87±0.13 vs1.21±0.14，P<0.05），已經(jīng)降至和WKY組相當(dāng)?shù)乃剑ˋCE/EF1α：0.44±0.19 vs0.33±0.12，P>0.05；ACE/β—actin：0.87±0.13 vs0.71±0.11，P>0.05）。干預(yù)后依那普利組ACE2的mRNA表達(dá)明顯高于SHR對(duì)照組（ACE2/EF1α：1.77±0.49 vs0.50±0.15，P<0.01），且己高出了WKY組的水平（ACE2/EF1α：

14、1.77±0.49 vs1.16±0.24，P<0.05），而ACE2蛋白表達(dá)和SHR對(duì)照組無差別（ACE2/β—actin：0.42±0.22 vs0.71±0.24，P>0.05），仍明顯低于WKY組的表達(dá)水平（ACE2/β—actin：0.42±0.22 vs1.22±0.14，P<0.01）。 （6）在SHR和WKY的心臟組織，ACE和ACE2主要表達(dá)在心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上。SHR心肌的ACE的免

15、疫表達(dá)明顯高于WKY組，ACE2的免疫表達(dá)明顯低于WKY組。依那普利能降低SHR心肌ACE的免疫表達(dá)，但對(duì)ACE2的免疫表達(dá)沒有影響。 結(jié)論： （1）SHR的血壓較同齡的對(duì)照品系WKY大鼠高，而體重較輕。其血壓在16—20周齡之間保持穩(wěn)定，無明顯演變。 （2）相對(duì)于同齡的對(duì)照品系WKY大鼠，20周齡的SHR的左室心肌明顯肥大，LVM和LVMI顯著升高，有明顯的心室重構(gòu)。 （3）15mg.kg—1.d—1劑

16、量的依那普利能顯著降低SHR血壓，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。 （4）SHR心臟ACE的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著升高，ACE2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低，ACE和ACE2之間這種平衡的失調(diào)可能是SHR高血壓形成的機(jī)制之一。 （5）依那普利能顯著降低SHR心臟ACE的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，顯著升高ACE2的mRNA水平，而對(duì)ACE2蛋白質(zhì)表達(dá)沒有明顯影響。依那普利對(duì)ACE和ACE2的這種影響可能是其作用機(jī)制之一。 （6）在