酶法水解牡蠣制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的研究.pdf

1、本試驗(yàn)以牡蠣為原料,選用適合的蛋白酶對其進(jìn)行水解,水解液經(jīng)過初步分離純化后,得到血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(ACEIP)。本論文主要包括以下幾個方面的工作。
　　 1.建立高效液相色譜法(HPLC)快速檢測血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性的方法。HPLC檢測條件為:以O(shè)DSC18柱(5μm,150mm×4.6mm)為色譜柱,乙睛-水(20:80,V/V,含0.5‰甲酸)為流動相,流速1mL/min,檢測波長為228nm。結(jié)果表明:

2、馬尿酸在0.1μg/mL～500μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r=0.9999;平均回收率為89.77％～99.57%,RSD為0.01%～1.52%。不同的ACE抑制劑檢測結(jié)果證明該方法操作簡便快速、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高,可以作為ACE抑制劑體外活性的檢測方法。
　　 2.采用檢測ACE酶活性的HPLC法,對自制豬肺ACE酶催化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明ACE與底物HGG的最佳反應(yīng)條件為:底物HGG和ACE的最

3、適反應(yīng)濃度分別為5mmol/L,和12.5mg/mL,反應(yīng)時(shí)間30min。以水解度(DH)為指標(biāo),測定了時(shí)間因素對不同蛋白酶酶解牡蠣蛋白的影響,表明4h時(shí)水解基本完全,中性蛋白酶水解度最高,達(dá)到89.88%,木瓜蛋白酶水解度最低,為34.51%。探討了牡蠣蛋白的水解度與ACE抑制活性的關(guān)系,證明水解15min后,酶解產(chǎn)物ACE抑制率可達(dá)較高水平,隨時(shí)間延長而緩慢增加或減少;其中胃蛋白酶水解牡蠣蛋白的酶解物對ACE的抑制率最高,1200U

4、/g底物的添加量、水解4h的條件下,其抑制率可達(dá)96.99%,且酶解物可保持至少12h內(nèi)穩(wěn)定存在不被水解。
　　 3.胃蛋白酶水解產(chǎn)物經(jīng)G75凝膠色譜分離可得A、B兩個蛋白峰,SDS-PAGE分析表明具ACE抑制活性的B峰分子量在6kDa以下,用G25凝膠層析分離B峰得到一個C峰,嘗試用反相高效液相色潛法(RP-HPLC)進(jìn)一步分離純化,在優(yōu)化的色譜條件下(色譜柱:ODSC18柱(5μm,150mm×4.6mm),流動相:乙睛-