肝病關(guān)聯(lián)基因IL-10-ESR1 rSNP的鑒定及其在HBV相關(guān)肝病中的功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是世界范圍內(nèi)主要的感染病之一，其疾病表型多種多樣，從無癥狀攜帶、急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎到肝衰竭、肝硬化、肝細(xì)胞癌，形成了復(fù)雜的疾病譜。HBV感染相關(guān)肝病的發(fā)生和發(fā)展是環(huán)境，病毒和宿主相互作用的結(jié)果。宿主因素，尤其是宿主基因，影響HBV感染和疾病進(jìn)程的許多階段。分離分析和雙生子研究提示宿主遺傳因素對(duì)HBV感染相關(guān)肝病疾病表型起著關(guān)鍵的作用。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，有關(guān)個(gè)

2、體遺傳變異與疾病的關(guān)系日益受到重視，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人類基因組中遺傳學(xué)變異最常見的一種類型，也是決定不同個(gè)體臨床表型多樣性的重要因素。因此探討HBV感染相關(guān)肝病的宿主遺傳易感性，將為我們從另一角度認(rèn)識(shí)HBV感染及發(fā)病機(jī)制提供新的線索，并為臨床防治提供新的、合理的策略。 以生物學(xué)功能相關(guān)基因作為候選基因進(jìn)行病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究，是當(dāng)前對(duì)復(fù)雜疾病進(jìn)行遺傳易感性研究

3、的重要策略。本課題組前期在中國(guó)人群15個(gè)HBV易感侯選基因的啟動(dòng)子區(qū)和外顯子區(qū)進(jìn)行了SNP的測(cè)序發(fā)掘。經(jīng)病例對(duì)照研究、核心家系傳遞不平衡測(cè)試，已確定雌激素受體旺(estrogen receptorα，ESR1)、干擾素-γ誘導(dǎo)的10KD蛋白分子(IP-10，CXCL10)和白介素10(interleukin10，IL-10)等多個(gè)基因與HBV感染及其疾病進(jìn)程相關(guān)。但既往研究多集中在侯選基因關(guān)聯(lián)SNP的發(fā)掘和HBV感染的關(guān)聯(lián)研究上，對(duì)陽(yáng)性

4、關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與其他HBV感染相關(guān)肝病的關(guān)聯(lián)研究還未見報(bào)道，對(duì)侯選基因的功能性SNP的鑒定也還不夠深入。進(jìn)一步研究肝病關(guān)聯(lián)基因IL-10/ESR1基因多態(tài)性與其他HBV相關(guān)肝病(HBV相關(guān)急性肝衰竭和/或肝硬化)的易感性之間的關(guān)系以及鑒定對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展起直接作用的調(diào)節(jié)性多態(tài)性位點(diǎn)，將有助于我們?nèi)胬斫釯L-10/ESR1基因多態(tài)性在HBV感染慢性化和重癥化機(jī)制中的作用。 因此，我們選擇IL-10和ESR1兩個(gè)基因?yàn)楹蜻x基因，擬在中國(guó)人

5、群中分析其基因多態(tài)性尤其是非編碼區(qū)(啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū))基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)肝病的關(guān)系，并對(duì)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)的生物學(xué)功能意義進(jìn)行功能驗(yàn)證，從遺傳學(xué)角度探討基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)肝病的易感性及發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。 本研究擬收集本研究所需的病例對(duì)照研究的臨床資料和DNA樣本，綜合采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)、擴(kuò)增折射變異PCR(ARMS-PCR)和直接測(cè)序法在我們收集的基于醫(yī)院的病例(如HBV相關(guān)急性肝衰竭，H

6、BV相關(guān)型肝硬化）對(duì)照(如健康獻(xiàn)血員，HBV感染無癥狀攜帶者)人群中對(duì)選擇的IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)SNPs(A-1082G，T-819C和A-592C)位點(diǎn)以及ESRl基因與陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)T29C連鎖的3個(gè)SNPs(IVS1 T-401/C，T29C和A252966G)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型、連鎖不平衡檢測(cè)、單倍型分析和關(guān)聯(lián)研究。然后綜合采用熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)(DLRA)、電泳移動(dòng)漂移分析(EMSA)、單倍型等位特異性染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(

7、HaploChIP)、位點(diǎn)特異性小RNA干擾(SiRNA)等手段對(duì)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽SNPs(IL-10 A-592C和ESR1 IVSl T-401C位點(diǎn))進(jìn)行功能驗(yàn)證。 我們的主要研究結(jié)果如下： 1.新收集了1000余份HBV感染患者的病例資料和血樣，完成了所有樣本(5000余例)的整理和疾病表型的歸類。 2.我們?cè)?45名HBV相關(guān)急性肝衰竭患者，367例HBV感染無癥狀攜帶者和414名健康獻(xiàn)血員正常對(duì)照中成功

8、進(jìn)行了IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)SNPs位點(diǎn)(A-1082G，T-819C和A-592C)分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)急性肝衰竭患者病例組中-592C和-819C的等位頻率顯著高于HBV感染無癥狀攜帶者疾病對(duì)照組和健康獻(xiàn)血員正常對(duì)照組(P=6.9×10-7)。經(jīng)非條件logistic回歸校正年齡、性別、飲酒指數(shù)等因素后，在顯性模式下，IL-10 A-592C和T-819C兩個(gè)SNP位點(diǎn)與HBV相關(guān)急性肝衰竭顯著關(guān)聯(lián)。和-592A/C或A/A

9、基因型個(gè)體相比，C/C基因型的個(gè)體對(duì)HBV相關(guān)急性肝衰竭易感性顯著升高(顯性模式：OR=2.07，95％CI1.47-2.92，P=0.0000)。 3.我們?cè)?59名HBV感染相關(guān)急性肝衰竭患者，469名HBV感染相關(guān)肝硬化患者和468例HBV感染無癥狀攜帶者對(duì)照中進(jìn)行ESR1基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)(IVS1 T-401C，T29C，A252966G)的分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)急性肝衰竭患者病例組和HBV相關(guān)肝硬化患者病例組中I

10、VS1-401C和29C的等位頻率顯著高于HBV感染無癥狀攜帶者疾病對(duì)照組。經(jīng)非條件logistic回歸校正年齡、性別等因素后，IVS1 T-401C和T29C兩個(gè)SNP位點(diǎn)與HBV相關(guān)急性肝衰竭(分別為P=0.0246，P=0.0071)以及HBV相關(guān)肝硬化(分別為P=3.0×10-4，P=5.4×10-6)的易感性顯著關(guān)聯(lián)。ESR1基因單倍型29C-401C增加了HBV相關(guān)急性肝衰竭(顯性模式：P=0.0116，OR=1.46，95

11、％CI1.08-1.96)以及HBV相關(guān)肝硬化(顯性模式：P=0.0000，OR=1.83，95％CI1.38-2.44)易感性。 4.體外EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)HBV感染相關(guān)急性肝衰竭相關(guān)聯(lián)的IL-10啟動(dòng)子區(qū)A-592C位點(diǎn)存在核蛋白結(jié)合位點(diǎn)，且兩種等位的結(jié)合能力存在差異。活體狀態(tài)下的ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)A-592C位點(diǎn)兩種等位都能與RNA多聚酶II特異性結(jié)合，但兩種等位的結(jié)合量表現(xiàn)為等位特異性差異，C等位的RNA多聚酶II特異性結(jié)合

12、量大于A等位，說明IL-10基因啟動(dòng)子-592C等位對(duì)IL-10表達(dá)的調(diào)控能力強(qiáng)于A等位。IL-10基因表達(dá)分析表明，攜帶有-592C等位的個(gè)體PBMC中IL-10 mRNA的表達(dá)和細(xì)胞因子水平也比不攜帶有有-592C等位的個(gè)體強(qiáng)。說明IL-10 A-592C兩個(gè)等位對(duì)IL-10的表達(dá)調(diào)控能力存在差異，C等位強(qiáng)于A等位。IL-10 A-592C位點(diǎn)是一個(gè)功能性調(diào)節(jié)性SNP，-592C等位通過上調(diào)IL-10基因的表達(dá)而增加了HBV相關(guān)肝衰

13、竭發(fā)病的危險(xiǎn)因素。 5.采用熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)、EMSA、HaploChIP、位點(diǎn)特異性RNA干擾等手段，多個(gè)角度首次證實(shí)了ESR1外顯子1 T29C位點(diǎn)連鎖的內(nèi)含子1 IVS1 T-401C位點(diǎn)的等位特異性順式調(diào)控作用，IVS1 T-401C位點(diǎn)兩個(gè)等位通過對(duì)核蛋白C-myb的結(jié)合能力的差異從而影響了ESR1的表達(dá)(mRNA和蛋白水平)，-40lC等位對(duì)核蛋白C-myb的結(jié)合能力更強(qiáng)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的增強(qiáng)子活性，可能通過影響了E

14、SR1表達(dá)量而增加了HBV相關(guān)肝衰竭和肝硬化發(fā)病的危險(xiǎn)因素。 總之，我們通過大樣本的病例對(duì)照研究在群體水平和流行病學(xué)角度首度證實(shí)了IL-10和ESR1基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)肝病(ALF和LC)的關(guān)聯(lián)，并通過系列功能研究證實(shí)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)IL-10啟動(dòng)子區(qū)A-592C和ESR1 IVS1 T-401C位點(diǎn)為功能性調(diào)節(jié)性SNP(regulatory SNP，rSNP)，其與疾病的關(guān)聯(lián)并不單純是一種標(biāo)志的間接關(guān)聯(lián)，而是通過影響了基因