人結(jié)腸癌細胞GOLPH3基因與Wnt信號通路的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　結(jié)直腸癌組織中GOLPH3過表達可促進癌細胞增殖，其機制與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)，本實驗通過對GOLPH3基因與Wnt信號通路活性的相關(guān)性進行研究，探討GOLPH3基因過表達促進結(jié)腸癌細胞增殖的相關(guān)機制。
　　方法：
　　1、RT-PCR檢測HCT116、HT29、SW480及SW620四種人結(jié)腸癌細胞中GOLPH3 mRNA的表達情況，選擇表達水平最高的人結(jié)腸癌細胞株繼續(xù)進行分組實驗。

2、
　　2、將人結(jié)腸癌SW620細胞株分為四個組：對照組、siRNA-GOLPH3轉(zhuǎn)染組、加Akt抑制劑Tricinbine組及加GSK-3β抑制劑TWS119組。
　　3、RT-PCR方法檢測結(jié)腸癌SW620細胞轉(zhuǎn)染siRNA-GOLPH3后的沉默效果。
　　4、通過Topflash報告基因活性檢測各組結(jié)腸癌SW620細胞Wnt信號通路的活性。
　　5、應用MTT法、平板克隆形成實驗檢測各組結(jié)腸癌SW620細胞的

3、增殖情況。
　　6、利用流式細胞技術(shù)檢測各組結(jié)腸癌SW620細胞的凋亡率。
　　7、Western Blot檢測各組結(jié)腸癌細胞中 GOLPH3、β-catenin、GSK-3β、pS9-GSK-3β蛋白的表達。
　　8、統(tǒng)計學分析各組實驗結(jié)果，探討GOLPH3基因過表達通過激活Wnt信號通路促進結(jié)腸癌細胞增殖的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR法檢測四種人結(jié)腸癌細胞株HCT116、HT29、SW48

4、0及SW620中GOLPH3 mRNA的表達水平（1.00±0.097）、（2.872±0.064）、（1.957±0.133）與（3.958±0.169）。GOLPH3 mRNA在結(jié)腸癌SW620細胞株中表達水平最高，選擇人結(jié)腸癌細胞株SW620進行后續(xù)的分組實驗。
　　2、人結(jié)腸癌細胞株SW620組和轉(zhuǎn)染組細胞GOLPH3 mRNA的表達水平分別為（1.000±0.092）和（0.236±0.076），轉(zhuǎn)染組表達水平顯著性低于

5、對照組（P<0.001），轉(zhuǎn)染效果良好。
　　3、對照組與三個實驗組(siRNA-GOLPH3；加 Tricinbine；加 TWS119)SW620癌細胞的相對熒光素酶活性（Relative Luciferase Activity），即相對 RLU值分別為（1.000±0.164）與（0.342±0.061）、（0.359±0.125）、（0.365±0.155），三個實驗組癌細胞的相對RLU值均明顯低于對照組（P<0.01），

6、并且各實驗組間相互對比，癌細胞的RLU值無顯著差別（P>0.05）。
　　4、MTT法檢測對照組與三個實驗組(siRNA-GOLPH3；加 Tricinbine；加 TWS119)癌細胞的生長抑制率分別為0與59.9％、56.6%、51.3%，各實驗組癌細胞的生長抑制率均高于對照組（P<0.05），同時各實驗組間互相對比，癌細胞的生長抑制情況無明顯差異（P>0.05）。
　　5、平板克隆形成實驗檢測對照組及三個實驗組(siR

7、NA-GOLPH3；加Tricinbine；加TWS119)SW620癌細胞的集落數(shù)分別為（207.333±17.786）、（82.333±15.144）、（93.333±12.342）、（95.667±16.563），各實驗組癌細胞集落數(shù)均顯著低于對照組（P<0.001），在各實驗組間的比較顯示癌細胞的克隆能力無差異性（P>0.05）。
　　6、對照組與三個實驗組(siRNA-GOLPH3；加 Tricinbine；加 TWS1

8、19)SW620癌細胞的凋亡率分別為（1.680±0.576）%與（52.467±4.373）%、（46.167±5.293）%、（50.167±6.506）%，實驗組癌細胞的凋亡比例均顯著性增加（P<0.001），且各實驗組間互相比較顯示癌細胞的凋亡情況差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　7、Western Blot檢測結(jié)果：
　　與對照組比較：
　　①在siRNA-GOLPH3組:癌細胞GOLPH3蛋白表達明顯

9、下降（P<0.001）,β-catenin蛋白表達明顯降低（P<0.001）,GSK-3β蛋白表達無差別（P>0.05）,pS9-GSK3β蛋白表達明顯降低（P<0.001）；
　?、诩覶ricinbine組：GOLPH3蛋白表達無差異（P>0.05）,β-catenin蛋白表達明顯降低（P<0.001），GSK-3β蛋白表達無差異（P>0.05），pS9-GSK3β蛋白表達明顯降低（P<0.001）；
　?、奂覶WS119

10、組：GOLPH3蛋白表達無差別（P>0.05）,β-catenin蛋白表達顯著降低（P<0.001），GSK-3β蛋白表達無差異（P>0.05），pS9-GSK3β蛋白表達顯著下降（P<0.001）。
　　各實驗組比較：
　?、貵OLPH3蛋白的表達在 siRNA-GOLPH3組低于加 Tricinbine組及加 TWS119組（P<0.05），并且后兩組間表達無差異性（P>0.05）；
　?、谠?siRNA-GOLP

11、H3組及加 Tricinbine組中β-catenin蛋白的表達無差別（P>0.05），但均低于加TWS119組的表達（P<0.05）；
　　③GSK-3β蛋白及 pS9-GSK3β蛋白在各實驗組中的表達的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、GOLPH3基因過表達可激活Wnt信號通路，上調(diào)β-catenin表達，促進結(jié)腸癌細胞增殖，抑制凋亡；
　　2、Akt、GSK3β活化可開啟Wnt信號通路