CD151缺失的結(jié)腸癌細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的變化對(duì)腫瘤血管生成作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而且發(fā)病年齡日趨年輕化，可能與人們逐漸西方化的飲食及生活方式有關(guān)。近年來(lái)隨著診斷技術(shù)和治療水平的提高，結(jié)直腸癌患者的生存期明顯延長(zhǎng)，但晚期結(jié)直腸癌依然是我國(guó)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。因此如何抑制腫瘤的進(jìn)展成為亟待解決的難題。人們發(fā)現(xiàn)血管生成在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其中CD151-整合素復(fù)合體可以將細(xì)胞外信號(hào)內(nèi)傳，激活細(xì)胞內(nèi)途徑，促進(jìn)血管的增

2、生。近年來(lái)Wnt信號(hào)通路作為與腫瘤密切相關(guān)的信號(hào)通路引起人們廣泛關(guān)注，它可以通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的調(diào)控影響腫瘤血管的生成，但CD151是否能通過(guò)Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤的血管生成，目前尚不明確。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT29）為參考對(duì)照，檢測(cè)敲除CD151基因的HT29細(xì)胞（CD151--HT29）中β-catenin基因及蛋白的表達(dá)變化，并對(duì)比觀察兩種細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)及血管增生的差異，探討CD151基因的表達(dá)通過(guò)

3、結(jié)腸癌中Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響血管增生的機(jī)制。
　　方法：
　　1運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)HT29細(xì)胞及CD151--HT29細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞及CD151--HT29細(xì)胞，經(jīng)過(guò)CK20檢測(cè)后用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物造模。
　　2運(yùn)用western blotting技術(shù)分別檢測(cè)HT29細(xì)胞和CD151--HT29細(xì)胞CD151蛋白的表達(dá)情況。
　　3運(yùn)用Real-T

4、ime PCR技術(shù)分別檢測(cè)HT29細(xì)胞和CD151--HT29細(xì)胞β-catenin mRNA的表達(dá)，探究CD151基因缺失狀態(tài)對(duì)β-catenin基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　4運(yùn)用western blotting技術(shù)分別檢測(cè)HT29細(xì)胞和CD151--HT29細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá)，探究CD151能否在蛋白水平影響Wnt信號(hào)通路的功能。
　　5將實(shí)驗(yàn)用裸鼠隨機(jī)分為2組，分別定義為 HT29細(xì)胞組和CD151--HT

5、29細(xì)胞組，將細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，建立移植瘤動(dòng)物模型，每日觀察裸鼠的生存狀態(tài)及成瘤時(shí)間等情況，每三天測(cè)量腫瘤體積繪制生長(zhǎng)曲線，21天后將荷瘤裸鼠處死，對(duì)比觀察其成瘤情況和移植瘤血管生成的差異。
　　結(jié)果：
　　1 Western blotting技術(shù)分別對(duì)實(shí)驗(yàn)用 HT29細(xì)胞及 CD151－-HT29細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示HT29細(xì)胞存在CD151蛋白的表達(dá)，而CD151－-HT29細(xì)胞CD151蛋白表達(dá)缺失。

6、>　　2 Real-Time PCR技術(shù)分別對(duì)HT29細(xì)胞和CD151－-HT29細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞中β-catenin mRNA的CT值分別為(14.65±1.23)和(14.05±1.16)，說(shuō)明HT29細(xì)胞β-catenin mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于CD151－-HT29細(xì)胞，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3 Western blotting技術(shù)分別對(duì)實(shí)驗(yàn)用 HT29細(xì)胞及 CD151－-HT29

7、細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示HT29細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)量高于CD151－-HT29細(xì)胞，其蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度值分別為（0.186±0.009）、（0.168±0.010），兩者的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4移植瘤檢測(cè)
　　(1) HT29細(xì)胞組及 CD151－-HT29細(xì)胞組瘤重分別為（1.175±0.127）、(1.059±0.142)，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明CD151－

8、-HT29組腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。
　　(2) HT29細(xì)胞組和CD151－-HT29細(xì)胞組移植瘤組織經(jīng)CD34染色后計(jì)算的 MVD值如下：HT29細(xì)胞組(42.20±5.36)個(gè)，CD151－-HT29細(xì)胞組(32.80±5.89)個(gè)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 HT29細(xì)胞移植瘤的增殖速度明顯高于敲除CD151基因HT29細(xì)胞組，推測(cè)CD151基因表達(dá)的下調(diào)有抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作