經(jīng)典Wnt信號(hào)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、背景介紹：
　　Wnt基因廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，并且在不同物種具有高度的保守性。經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路參與多種生理和病理機(jī)制，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞極性、遷移、凋亡等一系列重要過(guò)程，尤其在各種干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等生命活動(dòng)活躍的細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。迄今研究表明，經(jīng)典 Wnt信號(hào)功能失調(diào)與多種癌癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，不僅參與惡性腫瘤的發(fā)生，而且促進(jìn)其發(fā)展和轉(zhuǎn)移，包括乳腺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤等。

2、　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)指上皮樣細(xì)胞在特定的生理或病理環(huán)境中向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變分化的現(xiàn)象，其逆向過(guò)程稱為間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal epithelial transition, MET）。生理性EMT/MET多見于胚胎發(fā)育和組織愈合修復(fù)，而病理性EMT主要參與某些組織的纖維化及惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，是腫瘤細(xì)胞局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。在EMT過(guò)程中，上皮起

3、源的細(xì)胞失去其上皮樣表型并逐漸獲得間質(zhì)樣細(xì)胞表型，即細(xì)胞極性消失，細(xì)胞間的緊密連接減少，黏附能力降低，單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)不能維持，細(xì)胞的遷移、游走能力增加，從而表現(xiàn)出侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)。EMT細(xì)胞的典型分子表型變化主要是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E型鈣黏蛋白( epithelium-cadherin, E-cad)等表達(dá)降低，而N型鈣黏蛋白( N-cadherin, N-cad)、波形蛋白(Vimentin, Vim)等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)升高；且多種轉(zhuǎn)錄

4、因子也相應(yīng)呈現(xiàn)一系列變化。
　　EMT受多種分子信號(hào)通路調(diào)控，目前研究表明，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路（又稱Wnt/β-catenin通路）參與某些生理和病理的EMT/MET的調(diào)節(jié)。如在小鼠腎小管發(fā)育中，敲除 Wnt基因可有效阻斷間質(zhì)樣細(xì)胞遷移和組織局部腎小管上皮細(xì)胞的形成，采用基因敲除的方法干擾Wnt/β-catenin信號(hào)通路，顯著影響EMT介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的發(fā)生，顯示了該通路在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要意義，提示針對(duì)Wnt/β-cateni

5、n信號(hào)通路的靶向性治療具有阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在意義。目前已證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路失調(diào)是結(jié)腸癌發(fā)病的重要誘因，該通路是否促進(jìn)結(jié)腸癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移尚需進(jìn)一步研究。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)選用體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用基因重組蛋白Dkk1和Wnt3a分別抑制和激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polimerase chain reactio

6、n, PCR），觀察Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性改變對(duì)細(xì)胞遷移的影響以及對(duì)EMT特征性分子和相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因表達(dá)的影響，從而確定 Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1．HCT116細(xì)胞的體外培養(yǎng)。結(jié)腸癌細(xì)胞系 HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，用含10％胎牛血清（Fetal bovine Serum, FBS）的MyCoy’s5a培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸

7、液，以1×105/ml密度接種（5ml/瓶），置于37?C，5%CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至大約覆蓋培養(yǎng)瓶底部90%時(shí)，按照1：5的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
　　2．實(shí)驗(yàn)分組。HCT116細(xì)胞分為三組分別是：（1）對(duì)照組：HCT116細(xì)胞；（2）抑制劑組：HCT116細(xì)胞+Dkk1（100ng/ml）；（3）激動(dòng)劑組：HCT116細(xì)胞+Wnt3a（40ng/ml）。采用常規(guī)培養(yǎng)液制備 HCT116的單細(xì)胞

8、懸液，以1×106/孔的密度接種于六孔板，每組設(shè)3個(gè)平行孔。24h后待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)開始上述抑制劑和激動(dòng)劑的處理。
　　3．細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。HCT116細(xì)胞培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，覆蓋大約80%的培養(yǎng)板表面。用無(wú)菌槍頭在六孔板每孔中央沿直徑方向畫一條粗細(xì)均勻的劃痕，仔細(xì)刮去劃痕線右側(cè)所有的細(xì)胞，保留左側(cè)細(xì)胞完好。棄去培養(yǎng)基并用PBS沖洗3次除去漂浮的細(xì)胞，換成含2%FBS的MyCoy’s5a培養(yǎng)基，并按上述分組所示加入Dkk1（

9、100ng/ml）或Wnt3a（40ng/ml）。此時(shí)記為0h，使用倒置顯微鏡在每孔中沿劃痕線從上至下劃分為8個(gè)連續(xù)的觀察視野，分別在0h、12h、24h、48h時(shí)，觀察各個(gè)視野中的細(xì)胞遷移情況并采集圖片，將得到的細(xì)胞圖像數(shù)據(jù)用Image Pro Plus6.2進(jìn)行分析處理，分別計(jì)算對(duì)照組、抑制劑組和激動(dòng)劑組越過(guò)劃?rùn)M線的細(xì)胞數(shù)。
　　4．細(xì)胞周期檢測(cè)。HCT116細(xì)胞培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；按照方法2分組處理48h后，收集3組

10、細(xì)胞，PBS清洗3次，用冷無(wú)水乙醇固定過(guò)夜，離心后加入碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）和RNA酶混合的DNA染色溶液（每樣本200μl）重懸混勻，室溫下避光孵育30min后，PBS清洗3次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果采用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit進(jìn)行分析。
　　5．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因、EMT特征性分子及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因表達(dá)變化。采用總RNA提取試劑盒分別提取處理48h后對(duì)照組、

11、抑制劑組和激動(dòng)劑組的總RNA，使用Nanodrop精確測(cè)定RNA濃度和純度，各樣本以等量的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組基因表達(dá)變化，包括：Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因β-catenin，Axin2，C-myc，Wntless；EMT特征性分子的基因E-cad，N-cad，Vim；參與EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因Slug，Snail，ZEB1，ZEB2， Twist， MMP2，MMP3。β-actin為內(nèi)參基因，

12、 ROX為加樣參照熒光。根據(jù)-σTT分別計(jì)算抑制劑組和激動(dòng)劑組與對(duì)照組基因表達(dá)量的相對(duì)比值。
　　6．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，使用 SPSS10.1統(tǒng)計(jì)軟件，采用 t檢驗(yàn)法分別將抑制劑組和激動(dòng)劑組與對(duì)照組進(jìn)行分析比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1．HCT116細(xì)胞按1:5傳代，呈單層聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為上皮樣細(xì)胞，呈多邊形、卵圓形，細(xì)胞增殖能力旺盛，細(xì)胞之間連接緊密，胞間沒(méi)有空隙,連續(xù)傳代的細(xì)胞不

13、出現(xiàn)可識(shí)別的形態(tài)及生長(zhǎng)特性的改變。
　　2．調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的活性，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以看出，對(duì)照組至24h時(shí)才發(fā)生明顯細(xì)胞遷移；激動(dòng)劑組（Wnt3a-40ng/ml）在12h時(shí)就可以觀察到細(xì)胞遷移；抑制劑組（Dkk1-100ng/ml）在實(shí)驗(yàn)觀察的48h內(nèi)始終沒(méi)有明顯的細(xì)胞遷移現(xiàn)象。
　　3．調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的活性，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，對(duì)照組處于 S期的細(xì)胞占10.2%±0.45%，抑制劑組處

14、于 S期的細(xì)胞占9.4%±0.2%，激動(dòng)劑組處于 S期的細(xì)胞占11.1%±0.3%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，抑制劑組和激動(dòng)劑組分別與對(duì)照組的S期細(xì)胞相比，差異無(wú)顯著性。
　　4．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，采用Wnt3a（40ng/ml）處理48h顯著激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，表現(xiàn)為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵基因β-catenin和相關(guān)調(diào)控基因Wntless的表達(dá)顯著上調(diào)；同時(shí)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞

15、標(biāo)志物N-cad、Vim等表達(dá)顯著上調(diào)。當(dāng)采用Dkk1（100ng/ml）抑制 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性時(shí)，上述基因表達(dá)呈現(xiàn)相反的變化。統(tǒng)計(jì)分析顯示，抑制劑組和激動(dòng)劑組分別與對(duì)照組相比，差異具有顯著性（p<0.05）。
　　5．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果還顯示，EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子也出現(xiàn)明顯變化。當(dāng)Wnt3a（40ng/ml）激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路時(shí)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Snail、Slug、ZEB1、

16、Twist、MMP3表達(dá)均上調(diào)。相反，當(dāng)采用 Dkk1抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路時(shí)，上述基因表達(dá)下調(diào)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，抑制劑組和激動(dòng)劑組分別與對(duì)照組相比，差異具有顯著性（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．體外培養(yǎng)條件下，經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，激活該信號(hào)通絡(luò)可促進(jìn)細(xì)胞遷移和間質(zhì)樣細(xì)胞表型，抑制該信號(hào)通路結(jié)果相反。
　　2．經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)